Ръководство за анализ на проблеми

Следният анализ на проблемите, които може да срещнете вЗавод ОбщоRNA extraction will help you with your experiments. In addition, for other experimental or technical problems in addition to operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. If you have any needs, please contact us at: 028-83360257 or E-mali : Tech@foregene.com.

Центрофугата е запушена

Блокирането на въртящата се колона ще доведе до намаляване на добива на РНК или дори до невъзможност за пречистване за получаване на РНК и качеството на получената РНК ще бъде ниско.

Анализ на общата причина:

1. Пробата не е напълно счупена.

Непълната фрагментация на пробата може да блокира колоната за почистване на ДНК, което също може да повлияе на добива и качеството на РНК.Препоръчваме, когато извършвате фрагментиране на пробата, бързо да се смила в достатъчно количество течен азот, за да се разрушат тъканите като клетъчни стени и клетъчни мембрани на пробите, доколкото е възможно.За растителни проби от полифенолни полизахариди ви препоръчваме да използвате Plant Total RNA Isolation Kit Plus.

2. Аспирирайте изолирания супернатант от колоната за почистване на ДНК, аспирирайте възможните пелети от клетъчни остатъци.

Аспирираните пелети от клетъчни остатъци могат да запушат колоната само за РНК по време на процедурите за адсорбция на РНК (вижте стъпка 5 от процедурата, стъпка 6 от процедурата с полизахарид полифенол).Препоръчваме да се внимава, когато се аспирира този супернатант, за да се избегне аспирирането на клетъчни остатъци.

3. Първоначалното количество на пробата е твърде голямо.

Прекомерното използване на проби ще доведе до непълно фрагментиране на пробата или непълен лизис на клетки от буфер PRL1 или буфер PSL1, което води до запушена колона за пречистване за операции по пречистване.Комплектът за изолиране на обща растителна РНК има първоначален максимум от 50 mg за еднократно пречистване на работеща проба.За растителни проби от полифенолни полизахариди ви препоръчваме да опитате Plant Total RNA Isolation Kit Plus.

4. Температурата на центрофугата е твърде ниска.

Изолиране и пречистване на цяла РНК, с изключение на разрушаването на тъканта на пробата с течен азот, всички стъпки се извършват при стайна температура (20-25 °C).Някои нискотемпературни центрофуги имат температури под 20 °C, което може да причини запушвания в колоната за почистване на ДНК и/или колоната само за РНК.Ако това се случи, настройте температурата на центрофугата на 20-25 °C и предварително загрейте лизиращата смес и/или добавянето на супернатанта за разделяне на етанол до 37 °C.

Не е извлечена РНК или добивът на РНК е нисък

Обикновено има много фактори, които влияят на ефективността на възстановяване, като например: съдържание на РНК в пробата, метод на работа, обем на елуиране и др.

Анализ на често срещаните причини, както е показано по-долу:

1. По време на операцията беше извършено центрофугиране в ледена баня или ниска температура (4°C).

Предложение: Работете при стайна температура (15-25°C) през целия процес, не правете ледена баня и центрофугиране при ниска температура.

       2.РНК е разградена поради неправилно съхранение на пробата или дългосрочно съхранение на пробата.

Препоръка: Прясно събраните проби трябва бързо да се замразят в течен азот и след това да се съхраняват при -80°C за дълго време, избягвайте повторно замразяване и размразяване на пробите;или незабавно накиснете пробите в разтвор на РНК стабилизатор RNAlater (проби от животни).

       3.Недостатъчното фрагментиране на пробата и лизис водят до запушване на колоната за пречистване.

Предложение: Когато смилате тъканта, моля, уверете се, че тъканта е достатъчно смляна и бързо я прехвърлете в предварително приготвения буфер PSL1 (потвърдете, че е добавена правилната пропорция β-ME, вижте стъпка 1 от процедурата).

4. Елуентът е добавен неправилно.

Предложение: Уверете се, че ddH без RNase₂O се накапва в средата на мембраната на колоната за пречистване.

5.Правилният обем абсолютен етанол не е добавен към буфер PSL2 или буфер PRW2.

Предложение: Моля, следвайте инструкциите, добавете правилния обем абсолютен етанол към буфер PSL2 и буфер PRW2 и разбъркайте добре, преди да използвате комплекта.

6. Количеството тъканна проба е неподходящо.

Предложение: Използвайте 50 mg тъкан на 500 μl буфер PSL1.Използването на твърде много тъкан ще намали количеството извлечена РНК и чистотата на получената РНК също ще бъде намалена.Силно препоръчваме първоначалната доза на пробата да не надвишава 50 mg на операция за екстракция на РНК.

7. Неподходящ обем на елуиране или непълно елуиране.

Предложение: Обемът на елуента на колоната за пречистване е 50-200 μl;ако ефектът на елуиране не е задоволителен, се препоръчва да се удължи времето при стайна температура след добавяне на предварително загрят ddH без РНКаза₂O, например 5-10 минути.

8. Колоната за пречистване има остатък от етанол след промиване с буфер PRW2.

   Предложение: Ако празната епруветка се центрофугира за 1 минута и все още има останал етанол след промиване в буфер PRW2, можете да увеличите времето за центрофугиране на празната епруветка до 2 минути или да поставите колоната за пречистване на стайна температура за 5 минути, за да отстраните напълно остатъчния етанол.

9. Комплектът е използван неправилно.

   Предложение: За растителни проби от полифенолни полизахариди, използването на обикновени комплекти като комплекта за изолиране на тотална растителна РНК може да не успее да получи идеални РНК проби.Препоръчваме ви да използвате Plant Total RNA IsolationKit Plus, който е специално проектиран за растителни проби от полифенолни полизахариди.Комплект, специално разработен за извличане на РНК от полифенолни и полизахаридни растителни проби.

Стойността на OD260/OD280 е ниска

РНК елуиране с ddH₂O и използван за отчитане на спектрофотометър води до ниски стойности на OD260/OD280.Препоръчваме да използвате 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (вместо ddH без РНКаза₂O за елуиране на РНК), за да получите относително правилни стойности на OD260/OD280, вижте „Анализи за концентрация и пречистване на РНК“ на страница 19.

Пречистената РНК се разгражда

Качеството на пречистената РНК е свързано с фактори като запазване на пробата, замърсяване с РНКаза и манипулация.

Анализ на често срещаните причини:

1. Тъканните проби не са били съхранени навреме след вземането им.

    Препоръка: Ако тъканните проби не се използват навреме след вземането им, моля, съхранявайте ги незабавно в течен азот при ниска температура или ги прехвърлете при -80°C за дългосрочно съхранение след бързо замразяване в течен азот, или незабавно потопете пробите в разтвор на РНК стабилизатор RNAlater (проби от животни).За екстракция на РНК опитайте да използвате прясно събрани тъканни проби.

2. Многократно замразяване и размразяване на тъканни проби.

   Предложение: Когато съхранявате тъканни проби, най-добре е да ги нарежете на малки парчета за консервиране и да извадите част от тях, когато ги използвате, за да избегнете разграждането на РНК, причинено от многократно замразяване и размразяване на пробите.

3. РНКаза се въвежда в операционната зала или не се носят еднократни ръкавици, маски и др.

   Предложение: Експериментите за екстракция на РНК се извършват най-добре в отделни операции на РНК и лабораторната маса трябва да се почисти преди експеримента и трябва да се носят ръкавици и маски за еднократна употреба по време на експеримента, за да се избегне разграждането на РНК, причинено от въвеждането на РНКаза в най-голяма степен.

4. Реагентът е замърсен от РНКаза по време на употреба.

   Предложение: Заменете с нова серия комплекти за екстракция на обща РНК от растения за свързани експерименти.

5. Центрофужните епруветки и накрайниците на пипетите, използвани за манипулиране на РНК, са замърсени с РНКаза.

Предложение: Уверете се, че всички центрофужни епруветки, накрайници на пипети, пипети и др., използвани при екстракцията на РНК, не съдържат РНКаза.

Ръководства за употреба:

Ръководство с инструкции за комплект за изолиране на растителна тотална РНК