Колоната се запуши

След запушване на колоната, добивът на РНК е намален или дори невъзможно за пречистване на РНК и получената маса на РНК е ниска.

Анализ на често срещаната причина:

1. Прекъсванията на пробите не са задълбочени.

Счупването на пробата не причинява пълно блокиране на КОЛОНАТА ЗА ПОЧИСТВАНЕ на ДНК, като същевременно засяга добива и качеството на РНК.Препоръчваме бърза операция на смилане в достатъчно количество течен азот, когато счупите пробите. Опитайте се да смачкате клетъчната стена на пробата, клетъчната мембрана и друга тъкан.За растителни проби от полиолни полизахариди ви препоръчваме да използвате Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

2. При изсмукване на отделения супернатант от пробата с ДНК-почистваща колона, възможната клетъчно фрагментирана утайка може да бъде вдишана.

Взетите клетъчно фрагментирани утайки ще предизвикат колона САМО РНК, която ще бъде блокирана, когато се извърши операцията по адсорбция на РНК (вижте стъпка 6).Препоръчваме ви внимателно, когато изсмуквате този супернатант, за да избегнете изсмукване на клетъчни остатъци.

3. Първоначалната сума на пробата е твърде голяма.

Прекомерното използване на пробата ще доведе до непълно фрагментиране на пробата или непълен клетъчен лизис от буфер PSL1, което води до блокиране на колоната за пречистване по време на пречистването.Комплект за изолиране на обща растителна РНК Всяка единична пречистена работна проба е 50 mg.За растителни проби от полиолни полизахариди ви препоръчваме да опитате Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

4. Температурата на центрофугата е твърде ниска.

Целият процес на изолиране и пречистване на РНК се извършва при стайна температура (20-25°C), с изключение на това, че тъканта на пробата е разбита от течен азот. Температурата на някои криогенни центрофуги е по-ниска от 20℃, което може да причини блокиране на колоната за почистване на ДНК и/или колоната само за РНК.Ако това се случи, настройте температурата на центрофугата на 20-25℃, иуверете се, че лизиращата смес и/или супернатантата с добавен етанол е предварително загрята до 37°C.

Не е извлечена РНК или добивът на РНК е нисък

Обикновено има много фактори, които влияят на ефективността на възстановяване, като например: съдържание на РНК в пробата, метод на работа, обем на елуиране и др.

Анализ на често срещаните причини, както е показано по-долу:

1. По време на операцията беше извършено центрофугиране в ледена баня или ниска температура (4°C).

Предложение: Работете при стайна температура (15-25°В) в целия процес не правете ледена баня и центрофугиране при ниска температура.

2. РНК е била разградена поради неправилно съхранение на пробата или дългосрочно съхранение на пробата.

Препоръка: Прясно събраните проби трябва бързо да се замразят в течен азот и след това да се съхраняват при -80°C за дълго време, избягвайте повторно замразяване и размразяване на пробите;или незабавно накиснете пробите в разтвор на РНК стабилизатор RNAlater (проби от животни).

3. Недостатъчното фрагментиране на пробата и лизиране водят до запушване на колоната за пречистване.

Предложение: Когато смилате тъканта, моля, уверете се, че тъканта е достатъчно смляна и бързо я прехвърлете в предварително приготвения буфер PSL1 (потвърдете, че е добавена правилната пропорция β-ME, вижте стъпка 1 от процедурата).

4. Елуентът е добавен неправилно.

Предложение: Уверете се, че свободният от РНКаза ddH2O се накапва в средата на мембраната на колоната за пречистване.

5.Правилният обем абсолютен етанол не е добавен към буфер PSL2 или буфер PRW2.

Предложение: Моля, следвайте инструкциите, добавете правилния обем абсолютен етанол към буфер PSL2 и буфер PRW2 и разбъркайте добре, преди да използвате комплекта.

6. Количеството тъканна проба е неподходящо.

Предложение: Използвайте 50 mg тъкан на 500 μl буфер PSL1.Използването на твърде много тъкан ще намали количеството извлечена РНК и чистотата на получената РНК също ще бъде намалена.Силно препоръчваме първоначалната доза на пробата да не надвишава 50 mg на операция за екстракция на РНК.

7.Неподходящ обем на елуиране или непълно елуиране.

Предложение: Обемът на елуента на колоната за пречистване е 50-200 μl;ако ефектът на елуиране не е задоволителен, се препоръчва да се удължи времето при стайна температура след добавяне на предварително загрята ddH2O без РНКаза, например 5-10 минути.

8. Колоната за пречистване има остатък от етанол след промиване с буфер PRW2.

Предложение: Ако празната епруветка се центрофугира за 1 минута и все още има останал етанол след промиване в буфер PRW2, можете да увеличите времето за центрофугиране на празната епруветка до 2 минути или да поставите колоната за пречистване на стайна температура за 5 минути, за да отстраните напълно остатъчния етанол.

9. Комплектът е използван неправилно.

Предложение: За растителни проби от полифенолни полизахариди, използването на обикновени комплекти като комплекта за изолиране на тотална растителна РНК може да не успее да получи идеални РНК проби.Препоръчваме ви да използвате Plant Total RNA IsolationKit Plus, който е специално проектиран за растителни проби от полифенолни полизахариди.Комплект, специално разработен за извличане на РНК от полифенолни и полизахаридни растителни проби.

Стойността на OD260/OD280 е ниска

Елуирането на РНК с ddH2O и използваното за отчитане на спектрофотометър води до ниски стойности на OD260/OD280.Препоръчваме да използвате 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (вместо свободен от РНКаза ddH2O за елуиране на РНК), за да получите относително правилни стойности на OD260/OD280, вижте „Тестове за концентрация и пречистване на РНК“ на страница 19.

Пречистената РНК се разгражда

Качеството на пречистената РНК е свързано с фактори като запазване на пробата, замърсяване с РНКаза и манипулация.

Анализ на често срещаните причини:

1. Тъканните проби не са били съхранени навреме след вземането им.

Препоръка: Ако тъканните проби не се използват навреме след вземането им, моля, съхранявайте ги незабавно в течен азот при ниска температура или ги прехвърлете при -80°C за дългосрочно съхранение след бързо замразяване в течен азот, или незабавно потопете пробите в разтвор на РНК стабилизатор RNAlater (проби от животни).За екстракция на РНК опитайте да използвате прясно събрани тъканни проби.

2. Многократно замразяване и размразяване на тъканни проби.

Предложение: Когато съхранявате тъканни проби, най-добре е да ги нарежете на малки парчета за консервиране и да извадите част от тях, когато ги използвате, за да избегнете разграждането на РНК, причинено от многократно замразяване и размразяване на пробите.

3. РНКаза се въвежда в операционната зала или не се носят еднократни ръкавици, маски и др.

Предложение: Експериментите за екстракция на РНК се извършват най-добре в отделни операции на РНК и лабораторната маса трябва да се почисти преди експеримента и трябва да се носят ръкавици и маски за еднократна употреба по време на експеримента, за да се избегне разграждането на РНК, причинено от въвеждането на РНКаза в най-голяма степен.

4. Реагентът е замърсен от РНКаза по време на употреба.

Предложение: Заменете с нова серия комплекти за екстракция на обща РНК от растения за свързани експерименти.

5. Центрофужните епруветки и накрайниците на пипетите, използвани за манипулиране на РНК, са замърсени с РНКаза.

Предложение: Уверете се, че всички центрофужни епруветки, накрайници на пипети, пипети и др., използвани при екстракцията на РНК, не съдържат РНКаза.

Ръководства за употреба:

Plant Total RNA Isolation Kit Plus Ръководство с инструкции