1. Първоначално разбиране

На този етап трябва да разберем някои концепции и терминология, за да избегнем допускането на грешки пред нашите възрастни хора, като например:

Въпрос: Каква е разликата между RT-PCR, qPCR, PCR в реално време и RT-PCR в реално време?

Отговор: RT-PCR е PCR с обратна транскрипция(PCR с обратна транскрипция, RT-PCR), който е широко използван вариант на полимеразна верижна реакция (PCR).При RT-PCR една РНК верига се транскрибира обратно в комплементарна ДНК, която след това се използва като матрица за ДНК амплификация чрез PCR.
PCR в реално време и qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) са едно и също нещо, и двете са количествени PCR в реално време, което означава, че всеки цикъл на PCR има записи на данни в реално време, така че броят на началните шаблони може да бъде коригиран прецизен анализ.

Въпреки че както PCR в реално време (флуоресцентна количествена PCR в реално време), така и PCR с обратна транскрипция (PCR с обратна транскрипция) изглежда са съкратени като RT-PCR, международната конвенция е: RT-PCR конкретно се отнася до обратна транскрипцияPCR, PCR в реално време обикновено се съкращава като qPCR (количествена PCR в реално време).

И RT-PCR в реално време (RT-qPCR), Това е PCR с обратна транскрипция, комбиниран с флуоресцентна количествена технология: първо получете cDNA (RT) от обратна транскрипция на RNA и след това използвайте PCR в реално време за количествен анализ (qPCR).Повечето лаборатории правят RT-qPCR, т.е. изследване на понижаване на експресията на РНК, така че qPCR, за който всички говорят в лабораторията, всъщност се отнася до RT-qPCR, но не забравяйте, че все още има много ДНК тестове в клинични приложения.Количествен анализ, като откриване на HBV вирус на хепатит В.

Въпрос: След четене на много флуоресцентна количествена PCR, защо амплифицираният фрагмент трябва да се контролира в диапазона от 80-300 bp?

Отговор: Дължината на всяка генна последователност е различна, някои са няколко kb, някои са стотици bp, но трябва само да изискваме дължината на продукта да бъде 80-300 bp, когато проектираме праймери, твърде късите или твърде дългите не са подходящи за флуоресцентно количествено откриване на PCR.Фрагментът на продукта е твърде къс, за да бъде разграничен от праймера-димер.Дължината на праймер-димера е около 30-40 bp и е трудно да се разграничи дали е праймер-димер или продукт, ако е по-малък от 80 bp.Ако фрагментът на продукта е твърде дълъг, надвишаващ 300 bp, това лесно ще доведе до ниска ефективност на амплификация и не може ефективно да открие количеството на гена.

Например, когато преброите колко хора има в една класна стая, трябва да преброите само колко усти има.Същото важи и когато откривате гени, трябва само да откриете определена последователност от ген, за да представите. Цялата последователност ще свърши работа.Ако искате да броите хората, трябва да броите и устите, и носовете, и ушите, и очилата, а лесно се правят грешки.

За да разширим, в биологичните изследвания има много изследователски случаи от точка до област, тъй като генната последователност на всеки вид е много дълга, не е необходимо и невъзможно да се измерват всички фрагменти, като например бактериалното 16S секвениране, което е да се извърши консервативната последователност на бактериалните анализи, за да се направи извод за броя на определена популация от бактерии.

Въпрос: Каква е оптималната дължина за дизайн на праймер за qPCR?

Отговор: Най-общо казано, дължината на праймера е около 20-24 bp, което е по-добре.Разбира се, трябва да обърнем внимание на TM стойността на грунда, когато проектираме грунда, защото това е свързано с оптималната температура на отгряване.След много експерименти е доказано, че 60°C е по-добра стойност на ТМ.Ако температурата на отгряване е твърде ниска, това лесно ще доведе до неспецифично усилване.Ако температурата на отгряване е твърде висока, ефективността на усилване ще бъде относително ниска, пикът на кривата на усилване ще започне по-късно и стойността на CT ще се забави.

В: Как методът на багрилото е различен от метода на сондата?

Отговор: Метод на боядисванеНякои флуоресцентни багрила, като SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO и т.н., не излъчват светлина сами по себе си, но ще излъчват флуоресценция след свързване с второстепенната бразда на двойноверижната ДНК.Следователно, в началото на PCR реакцията, машината не може да открие флуоресцентния сигнал.Когато реакцията достигне етапа на отгряване-удължаване, двойната верига се отваря и се синтезира нова верига под действието на ДНК полимераза и флуоресцентната молекула се свързва с малката бразда на dsDNA.Тъй като броят на PCR циклите се увеличава, все повече и повече багрила се комбинират с двойноверижна ДНК и флуоресцентният сигнал също непрекъснато се усилва.Методът на багрилото се използва главно в научните изследвания.
PS: Внимавайте, когато правите експеримента, багрилото трябва да се комбинира с човешка ДНК, внимавайте да го превърнете във флуоресцентно лице.

Метод на багрило (вляво) Метод на сонда (вдясно)
PS: Внимавайте, когато правите експеримента, багрилото трябва да се комбинира с човешка ДНК, внимавайте да го превърнете във флуоресцентно лице.

SYBR Green Ⅰ се свързва с малката бразда на ДНК

Метод на сондатаСондата Taqman е най-често използваната сонда за хидролиза.Има флуоресцентна група в 5' края на сондата, обикновено FAM, а самата сонда е последователност, комплементарна на целевия ген.Има флуоресцентна гасителна група в 3' края.Съгласно принципа на флуоресцентен резонансен пренос на енергия (Förster resonance energy transfer, FRET), когато репортерната флуоресцентна група (донорна флуоресцентна молекула) и охлаждащата флуоресцентна група (акцепторна флуоресцентна молекула) са възбудени Когато спектрите се припокриват и разстоянието е много близко (7-10nm), възбуждането на донорната молекула може да индуцира флуоресценцията на акцепторната молекула, докато автофлуоресценцията е отслабена.Следователно, в началото на PCR реакцията, когато сондата е свободна и непокътната в системата, репортерната флуоресцентна група няма да излъчва флуоресценция.При отгряване праймерът и сондата се свързват с шаблона.По време на етапа на удължаване полимеразата непрекъснато синтезира нови вериги.ДНК полимеразата има 5'-3' екзонуклеазна активност.Когато достигне сондата, ДНК полимеразата ще хидролизира сондата от матрицата, ще отдели репортерната флуоресцентна група от гасителната флуоресцентна група и ще освободи флуоресцентния сигнал.Тъй като има връзка едно към едно между сондата и шаблона, методът на сондата е по-добър от метода на багрилото по отношение на точността и чувствителността на теста.Методът на сондата се използва главно в диагностиката.

Въпрос: Какво е абсолютно количествено определяне?Какво е относително количествено определяне?

Отговор: Абсолютното количествено определяне се отнася до изчисляването на първоначалния брой копия на пробата, която ще бъде тествана чрез qPCR, като например колко HBV вируси има в 1 ml кръв.Резултатът, получен чрез относително количествено определяне, е промяната в количеството на целевия ген в специфична проба спрямо друга референтна проба и генната експресия е регулирана нагоре или надолу.

В: Количеството екстракция на РНК, ефективността на обратната транскрипция и ефективността на амплификацията ще повлияят ли върху експерименталните резултати?
В: Съхранението на пробите, реагентите за екстракция, реагентите за обратна транскрипция и консумативите, предаващи светлина, ще повлияят ли на експерименталните резултати?
Въпрос: Какъв метод може да коригира експерименталните данни?

По отношение на тези проблеми ще ги опишем подробно в разделите за напреднали и за напреднали по-долу.
2. Разширено знание

По отношение на флуоресцентната количествена PCR в реално време, трябва да признаем реалността, че всяка година се публикуват хиляди научни статии, сред които флуоресцентната количествена PCR технология не е малък брой.

Ако няма общ стандарт за измерване на флуоресцентния количествен PCR експеримент, резултатите може да варират значително.За един и същ ген от един и същи вид, със същия метод на обработка, резултатите от откриването също ще варират значително и ще бъде трудно за закъснелите да повторят същите резултати.Вие Никой не знае кое е правилно и кое грешно.

Това означава ли, че флуоресцентната количествена PCR е измамна технология или ненадеждна технология?Не, това е така, защото флуоресцентният количествен PCR е по-чувствителен и по-точен и малко погрешна операция ще доведе до напълно противоположни резултати.Малка загуба е на хиляди мили.Авторът на статията може да бъде многократно измъчван от рецензентите.В същото време рецензентите на списанието също са трудни за избор от различни експериментални резултати.

Като цяло, което показва липсата на консенсус в PCR експериментите в реално време.За тази цел старши учени в индустрията започнаха да формулират стандарти,изискване от сътрудниците да предоставят някои необходими подробности за експеримента и обработката на данни (включително необходимите данни) в статията, за да отговарят на тези стандарти.

Рецензентите могат да преценят качеството на експеримента, като прочетат тези подробности;бъдещите читатели също могат да използват това, за да повторят експеримента или да го подобрят.Тогава получените по този начин експериментални резултати са пълни с информация, качествени и използваеми.

MIBBI (Минимална информация за биологични и биомедицински изследвания -http://www.mibbi.org) възниква.MIBBI е проект, който предоставя стандарти за експерименти.Издава се в природата.Този проект е насочен към различни биологични експерименти, включително клетъчна биология, Microarray, qPCR, които ще обсъдим сега, и т.н., и предвижда всеки тип експеримент при изпращане на ръкописи.Тази информация трябва да се предоставя по всяко време.

В проекта MIBBI има две статии, свързани с флуоресцентна количествена PCR, а именно:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – структуриран език и ръководство за докладване за количествени PCR данни в реално време;
·MIQE (Минимална информация за публикуване на количествени PCR експерименти в реално време) – минимална информация за публикуване на статии за количествени PCR експерименти в реално време.
Първо, нека поговорим за RDML, спецификацията на терминологията.

Ако няма стандартна дефиниция за всичко, е невъзможно да продължим дискусията, поради което обяснението на термините е толкова важно на изпита.
Терминологията, използвана във флуоресцентния количествен PCR експеримент, включва следното съдържание.QIAGEN направи най-доброто обобщение за нас.Следващите са всички сухистоки .

Крива на усилване
Кривата на амплификация се отнася до кривата, направена по време на PCR процеса, с номера на цикъла като абсцисата и интензитета на флуоресценция в реално време по време на реакцията като ордината.

Отличната крива на усилване трябва да има следните характеристики: базовата линия е равна или леко понижена и няма очевидна възходяща тенденция;инфлексната точка на кривата е ясна и наклонът на експоненциалната фаза е пропорционален на ефективността на усилване.Колкото по-голям е наклонът, толкова по-висока е ефективността на усилване;общата крива на усилване Паралелизмът е добър, което показва, че ефективността на усилване на всяка тръба е сходна;експоненциалната фаза на кривата на усилване на проби с ниска концентрация е очевидна.

Базово ниво (Базово ниво)
Базовата линия е нивото на шума на ранния цикъл, обикновено се измерва между 3-тия и 15-ия цикъл, тъй като увеличението на стойността на флуоресценцията, причинено от продукта на амплификация, не може да бъде открито през този период.Броят на циклите, използвани за изчисляване на базовата линия, може да варира и може да се наложи да бъде намален, ако се използват големи количества на матрицата или ако нивото на експресия на целевия ген е високо.

Задаването на базовата линия изисква преглед на данните за флуоресценцията от кривата на усилване на линейността.Базовата линия е зададена така, че растежът на кривата на усилване да започне с номер на цикъл, по-голям от горния номер на цикъла на базовата линия.Базовите линии трябва да се задават индивидуално за всяка целева последователност.Средните стойности на флуоресценция, открити в ранните цикли, трябва да бъдат извадени от стойностите на флуоресценция, получени в амплифицираните продукти.Най-новите версии на различни софтуери за PCR в реално време позволяват автоматично оптимизиране на базовите настройки за отделни проби.

По време на първите няколко цикъла на реакцията на PCR амплификация, флуоресцентният сигнал не се променя много.Приближаването към права линия се нарича базова линия, но ако се вгледаме внимателно в първите няколко цикъла, виждаме, че в рамките на основната линия е това, което се случва на снимката по-долу.

Фон Фонът се отнася за
стойността на неспецифичната флуоресценция в реакцията.Например: неефективно потушаване на флуоресценцията;или голям брой двойноверижни ДНК шаблони поради използването на SYBR Green.Фоновите компоненти на сигнала се премахват математически от софтуерния алгоритъм на PCR в реално време.

Репортерски сигнал
Репортерният сигнал се отнася до флуоресцентния сигнал, генериран от SYBR Green или флуоресцентно маркирани сонди, специфични за последователност, по време на PCR в реално време.

Нормализиран репортерен сигнал (RN)
RN се отнася до интензитета на флуоресценция на репортерното багрило, разделен на интензитета на флуоресценция на пасивното референтно багрило, измерен при всеки цикъл.

Пасивна еталонна боя
В някои PCR в реално време,флуоресцентното багрило ROX се използва като вътрешна референция за нормализиране на флуоресцентния сигнал.Той коригира вариациите, дължащи се на неточно пипетиране, позиция на ямка и флуктуации на флуоресценцията на база ямка по ямка.

Прагът на флуоресценция (праг)
беше коригирана над фоновата стойност и значително под стойността на платото на кривата на усилване.Той трябва да лежи в линейната област на кривата на амплификация, представляваща логаритмично линейния обхват на PCR откриване.Праговете трябва да бъдат зададени в изгледа на кривата на логаритмична амплификация, така че линейната логаритмична фаза на PCR да може лесно да се идентифицира.Ако има множество целеви гени в PCR в реално време, прагът трябва да бъде зададен за всяка цел.Обикновено флуоресцентният сигнал от първите 15 цикъла на PCR реакцията се използва като флуоресцентен фонов сигнал, а прагът на флуоресценция е 10 пъти стандартното отклонение на флуоресцентния сигнал от първите 3 до 15 цикъла на PCR, а прагът на флуоресценция се задава в експоненциалната фаза на PCR амплификацията.По принцип всеки инструмент има свой праг на флуоресценция, зададен преди употреба.

Праг на цикъла (CT) или пресечна точка (CP)
Цикълът, при който кривата на усилване пресича прага (т.е. точката, при която откриването на флуоресценция нараства значително).CT може да бъде дроб и количеството на началния шаблон може да бъде изчислено.CT стойността представлява броя на циклите, извършени, когато флуоресцентният сигнал във всяка PCR реакционна епруветка достигне зададения праг.Съществува линейна зависимост между CT стойността на всеки шаблон и логаритъма от първоначалния номер на копие на шаблона,по-голям е първоначалният брой копия, толкова по-малка е стойността на CT и обратно.Стандартна крива може да бъде направена чрез използване на стандарт с известен начален номер на копие, където абсцисата представлява стойността на CT, а ординатата представлява логаритъм от първоначалния номер на копие.Следователно, докато се получи CT стойността на неизвестната проба, първоначалният брой копия на пробата може да се изчисли от стандартната крива.

ΔCT стойност
Стойността на ΔCT описваразликата между целевия ген и съответния ендогенен референтен ген CT стойност, като домакински ген, и се използва за нормализиране на количеството използван шаблон:
⇒ΔCT = CT (целеви ген) – CT (ендогенен референтен ген)

ΔΔCT Стойност
Стойността ΔΔCT описва разликата между средната стойност на ΔΔCT на проба от интерес (напр. стимулирани клетки) и средната стойност на ΔΔCT на референтна проба (напр. нестимулирани клетки).Референтната проба се нарича още проба за калибриране и всички други проби се нормализират към това за относително количествено определяне:
⇒ΔΔCT = средно ΔCT (представляваща интерес проба) – средно ΔCT (референтна проба)

Ендогенни референтни гени (ендогенни референтни гени)
Нивата на експресия на ендогенни референтни гени, като домакински гени (домакински гени), не се различават между пробите.Сравняването на CT стойностите на референтния ген с целевия ген позволява нивото на експресия на целевия ген да бъде нормализирано до количеството на входящата РНК или кДНК (вижте раздела за ΔCT стойностите по-горе).

Вътрешните референтни гени са правилни завъзможно разграждане на РНК или наличие на ензимни инхибитори в РНК проби, както и вариации в съдържанието на РНК, ефективност на обратната транскрипция, възстановяване на нуклеинова киселина и манипулиране на пробите.За да изберем оптималния референтен ген(и), ние модифицирахме алгоритъма, за да позволим неговия избор на оптимална референтна стойност в зависимост от експерименталната настройка.

Вътрешен контрол
Контролна последователност, която е амплифицирана в същата реакция като целевата последователност и изследвана с различна проба (т.е. извършване на дуплексна PCR).Вътрешните контроли често се използват за изключване на неуспешни амплификации, като например когато целевата последователност не е открита.
Проба за калибриране
Референтна проба (например пречистена РНК от клетъчна линия или тъкан), използвана при относително количествено определяне за сравняване на всички други проби за определяне на относителното ниво на експресия на ген.Пробата за калибриране може да бъде всяка проба, но обикновено е контрола (например нетретирана проба или проба от нулевия момент на експеримента).

Положителни контроли
използвайте контролни реакции сизвестни количества шаблон.Положителните контроли често се използват, за да се провери дали комплект праймер или комплект праймер-сонда работи правилно и че реакцията е настроена правилно.

Без контрол на шаблона (NTC)
Контролна реакция, която съдържа всички необходими компоненти на реакцията на усилване, с изключение на матрицата, която обикновено се заменя с вода.Използването на NTC може да открие замърсяването, причинено от замърсяване с реагент или чужда ДНК, като по този начин гарантира автентичността и надеждността на данните за откриване.Усилването на NTC контрола показва замърсяване.

Без RT контрол (NRT)
Процесът на екстракция на РНК може да съдържа остатъчна геномна ДНК, която е изключително вредна и е виновникът, засягащ качеството на данните и естественият враг на qPCR, така че при проектирането на експерименти той трябва да бъде проектиран така, че да усилва само откриването на РНК.Има два начина, единият е да се проектират праймери през интрони, другият е да се премахне напълно ДНК, кой от тях е по-добър, което ще бъде обсъдено по-късно.Контролът NTR е магическо огледало за откриване на замърсяване на ДНК.Ако има усилване, това означава, че има замърсяване.

Стандарти
Стандартите са проби с известна концентрация или брой копия, които се използват за конструиране на стандартна крива.За да се гарантира стабилността на стандарта, генният фрагмент обикновено се клонира в плазмида и се използва като стандарт.

Стандартната крива
обикновено се разрежда в най-малко 5 концентрационни градиента със стандартния продукт според съотношението на удвояване и 5 точки се изчертават в координатите на CT стойността и броя на копията и точките се свързват, за да образуват линия за генериране на стандартна крива.За всяка стандартна крива трябва да се провери нейната валидност.Стойността на наклона пада между –3,3 и –3,8 и всяка концентрация се извършва в три екземпляра.Точките, които са значително различни от другите точки, трябва да бъдат изхвърлени.CT стойността на пробата, която ще се тества, се въвежда в стандартната крива и нивото на експресия на пробата, която ще се тества, може да бъде изчислено.

CT стойността на пробата, която ще се тества, се въвежда в стандартната крива и може да се изчисли първоначалният брой копия на пробата, която ще се тества.

Ефективност и наклон
Наклонът на стандартната крива представлява ефективността на PCR в реално време.
· Наклон от -3,322 показва, че ефективността на PCR амплификация е 1, или 100% ефективна, и количеството на PCR продукта се удвоява при всеки цикъл.
· Наклон, по-малък от –3,322 (напр. –3,8) показва ефективност на PCR
· Наклон, по-голям от –3,322 (напр. –3,0) показва, че ефективността на PCR изглежда е по-голяма от 100%, което е любопитно, как може един цикъл на PCR да генерира повече от два пъти амплифицирания продукт?Тази ситуация възниква в нелинейната фаза на PCR реакцията, тоест има голямо количество неспецифична амплификация.

крива на топене
След като qPCR амплификацията приключи, PCR продуктът се нагрява.С повишаването на температурата, двойноверижният продукт на амплификация постепенно се топи, което води до намаляване на интензитета на флуоресценция.Когато се достигне определена температура (Tm), голям брой продукти ще се стопят.Флуоресценцията рязко спада.Различните PCR продукти имат различни Tm стойности и различни температури на топене, така че специфичността на PCR може да бъде идентифицирана.

Крива на топене (производна крива)
Кривата на топене се извлича, за да формира пикова карта, която може по-интуитивно да покаже ситуацията на фрагментите на PCR продукта.Тъй като температурата на топене е стойността на Tm на ДНК фрагмента, някои параметри, които влияят на стойността на Tm на ДНК фрагмента, могат да бъдат оценени, като размер на фрагмента, съдържание на GC и т.н. Най-общо казано, според нашите принципи за проектиране на праймера,дължината на амплифицирания продукт е в диапазона 80-300 bp, така че температурата на топене трябва да бъде между 80°C и 90°C.

Тълкуване на кривата на топене: Ако единственият основен пик се появи между 80°C-90°C, това означава, че флуоресцентната количествена PCR е перфектна;ако основният пик се появява между 80°C-90°C и различни пикове се появяват под 80°C, основно се взема предвид димерът на праймера.Можете да опитате да увеличите температурата на отгряване, за да го разрешите;ако основният пик се появи между 80°C-90°C, а допълнителният пик се появи отново, когато температурата се повиши, основно се счита, че има ДНК замърсяване и ДНК трябва да бъде отстранена в началния етап на експеримента.

Разбира се, все още има някои необичайни ситуации, които ще бъдат разделени една по една по-долу.
3. Разширено знание

За да направя qPCR, трябва да кажа MIQE,Минимум информацияза публикуване наКоличествениPCR в реално времеЕксперименти — минималната информация за публикуване на статии за количествена PCR в реално времеексперименти .За да опростим разбирането на всички, ние ще опростим основното съдържание.

Можете да потърсите оригиналния текст на MIQE в интернет, като най-важното е, че той предвиждасписък с данни, които трябва да бъдат предоставени при публикуване на статия .

Рецензентите могат да преценят качеството на експеримента, като прочетат тези подробности;бъдещите читатели също могат да използват това, за да повторят или подобрят експеримента.
Струва си да се отбележи, че в този списък важността на всеки списък е отбелязана съответно с E или D.Какво означава?E: съществена информация (трябва да се предостави);D: желана информация (предоставете колкото е възможно повече).

MIQE (1)—Експериментален дизайн
Много мръсници, които са завършили защитата си, след като са завършили аспирантурата си, няма да знаят как да направят самостоятелно експеримент, да отворят тетрадките си и да направят това, което учителят им казва.В резултат на това експерименталният дизайн не беше строг и редакционният отдел на списанието каза, че искат да измислят тази снимка и тази снимка, така че го направиха в замаяност.Така се правят мръсниците!

По-близо до дома, първият принцип на експеримента е да се определистрогостта на експерименталната логика.Най-фундаменталното нещо е експерименталният дизайн и най-важното нещо за експерименталния дизайн е как да се зададе целевата проба, референтната проба (контрола) и броя на повторенията, така че експерименталните данни да могат да бъдат референтни, сравними и убедителни.

Целевата пробасе отнася до пробата, която изисква от нас да открием целевия ген след определено лечение.Референтната пробае пробата без никаква обработка, която често се нарича див тип в биологията.

Експериментални репликиса много важни.Обикновено броят на убедителните реплики трябва да бъде повече от три.Необходимо е да се разграничи какво е биологична репликация и какво е техническа репликация.

Биологични реплики: Същият експеримент за проверка, извършен с различни материали (време, растения, партиди, реакционни плочи).

Биологично дублиране
Да вземем за пример обработката на пипера с пестициди.Искаме да напръскаме с пестициди трите растения на ABC, тогава трите растения на ABC са три биологични реплики и те са един и същ експеримент за проверка, извършен с различни материали.Но като експеримент определено е необходима контрола, така че можем да напръскаме един от клоните на растение А, за да формираме експериментална група от растение А, и да не пръскаме другите клони на растение А, за да формираме контролна група.Направете същото за B и C.

Технически реплики (технически реплики): Това е повтарящ се експеримент, предназначен да избегне грешки, причинени от операция, която всъщност е дублирана дупка, включена в същия материал.Както леченията, така и контролите трябва да имат настройки за репликация (минимум три) на целевия ген и вътрешния референтен ген.

Техническо повторение
Вземете за пример отново третирания с пестициди пипер.За експерименталната група от растение А направихме три PCR дупки от 1, 2 и 3 съответно за неговия целеви ген и вътрешен референтен ген, така че да вземем средната стойност след откриването.За контрола на растения А групи също се третират по същия начин.По същия начин направете същото третиране за B и C растения.Това е техническо повторение.

Заслужава да се отбележи, четова, което влиза в статистиката, е биологичното повторение, а техническото повторение е да се провери дали има някакви случайни явления в експерименталния процес, така че да се направят експерименталните резултати достоверни, тоест да се избегнат грешки, като се вземе тяхната средна стойност, както често казваме.

Отрицателни контроли—NTC и NRT
NTC (контрол без шаблон), контрола без шаблон, се използва за проверка дали експерименталният материал е замърсен.Обикновено водата се използва като шаблон.Ако има флуоресцентна реакция, това показва, че в лабораторията е настъпило замърсяване с нуклеинова киселина.

Тези замърсявания идват от: нечиста вода, неквалифицирани реагенти, съдържащи ендогенна ДНК, замърсяване с праймер, замърсяване с лабораторно оборудване, аерозолно замърсяване и т.н., трябва да се използват RNase cavengers и RNase инхибитори.Аерозолното замърсяване е най-трудното за намиране.Представете си, че вашата лаборатория е като смог с различни нуклеинови киселини, суспендирани във въздуха.

NRT (без обратна транскриптаза), контролата без обратна транскрипция, е необратно транскрибираната РНК като отрицателна контрола, която е контролата на gDNA остатъка.

Когато се прави генна експресия, количеството РНК се открива чрез откриване на количеството сДНК след обратна транскрипция.Ако има gDNA остатък, когато РНК се пречиства, това ще доведе до грешки в експерименталните резултати, тъй като реално получените резултати са gDNA и cDNA.На агрегатно ниво, не само cDNA, gDNA трябва да бъде напълно отстранена по време на екстракцията на РНК.

MIQE (2)—примерна информация
Така наречената примерна информация означава, че когато публикуваме статия за qPCR, трябва ясно да обясним примерната информация, която е незаменима част от статията.По същия начин, когато обработваме проби, ние също трябва да регулираме нашите собствени операции, за да гарантираме валидността на пробите.

Описанието на пробата е само резултат и трябва да обърнем повече внимание на материалите, взети по време на целия експеримент.

Подбор на експериментални материали
Кръвни проби – изберете прясна кръв, не повече от 4 часа.Клетъчни проби – изберете да вземете свежи клетки в период на буен растеж.Животинска тъкан - Изберете свежа, енергично растяща тъкан.Растителна тъкан – Изберете свежа, млада тъкан.

Сигурно сте забелязали, че в тези няколко изречения има ключова дума: свеж.
За горните проби най-добрият, рентабилен и стабилен комплект на пазара е комплектът на Foregene, който може бързо и лесно да извлече тяхната ДНК и РНК.

Мини комплект кръвна ДНК

Комплект за изолиране на обща РНК клетка

Комплект за изолиране на тотална РНК от животни

Комплект за изолиране на обща растителна РНК

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Комплект за изолиране на растителна ДНК

Съхранение на опитни материали
Най-общо казано, не препоръчваме да съхранявате проби, ако условията го позволяват.Въпреки това има много приятели, които не могат да провеждат експерименти веднага след вземането на проби, а някои дори трябва да носят резервоари с течен азот на полето за вземане на проби.

За този вид трудолюбив приятел мога само да кажа, че не разбирате от консумативи за реагенти.Сега много компании за консумативи на реагенти произвеждат реагенти, които могат да съхраняват РНК проби при стайна температура и вие можете да изберете да ги използвате.Конвенционалният метод за съхранение е съхранение на течен азот, като се използва малък резервоар за течен азот, който е лесен за пренасяне.След като върнете пробата обратно в лабораторията, съхранявайте я в хладилник при -80°C.

За експерименти, включващи РНК, трябва да се следва принципът от шест думи:ниска температура, без ензими,ибърз .

Концепцията за ниска температура е лесна за разбиране;без ензими, RNase е навсякъде по света, в който живеем (в противен случай щяхте да бъдете убит от ХИВ), така че как да избегнете RNase, когато правите експерименти, е много важна концепция;бърз,Няма кунг-фу в света, което да не може да бъде нарушено, само скоростта не може да бъде нарушена.

Следователно, в известен смисъл, колкото по-кратко е времето за екстракция, толкова по-добър е комплектът.ЗащоForegineКомплектът набляга на скоростта, защото я познава добре.

PS: Някои момичета правят експерименти много внимателно, но не са толкова добри, колкото забиване след няколко години работа.Те смятат, че Бог е несправедлив, оплаква се от другите и търси живот.Всъщност тя не го разбираше.Той не защити добре РНК-то и играчът на забиване беше пъргав.Когато правеше експеримента, той мислеше, че ще завърши ударното забиване с три пъти, пет пъти и две деления, но направи експеримента добре.

Забележка: По-бавно, повече шансове за инвазия на РНКаза.Как да се обучите да бъдете бързи?Няма начин, просто практикувайте повече.

За различни експерименти и различни проби все пак е необходимо да се прочете повече литература и да се избере подходящ метод за обработка.За процеса на събиране и съхранение на проби, MIQE изисква той да бъде ясно написан в хартията, така че рецензентите да могат да прегледат надеждността на хартията, а също така е удобно за зашеметените младежи да повторят вашия експеримент.

Въпреки че биологичните експерименти са трудни, те са от висок клас.Ако не внимавате, можете да преобърнете света.Например превръщането на SARS в биохимична криза или създаването на хибриден ориз за спасяването на 1,3 милиарда души.Картината по-долу е химичен експеримент, трябва да разберете колко се гордеете с вашето изследване само като погледнете вида му, подобен на пишка.Забрави, не го черни.

MIQE (3) – извличане на нуклеинова киселина.
Екстракцията на нуклеинова киселина е голямо събитие и всички експерименти по молекулярна биология започват с екстракция на нуклеинова киселина.Първо, нека копираме съдържанието на MIQE за извличане на нуклеинова киселина.

Гледайки тази форма, не можете да останете на повърхността.Формата е догма.За да бъдеш отличен ученик, трябва да попиташ защо.Основното съдържание на тази таблица е: Преследванечистотата, целостта, консистенцията и екстрахираното количество РНК .

Първата част напроцес или инструмент е етапът на екстракция на нуклеинова киселина.Ако използвате автоматичен екстрактор на нуклеинова киселина за извличане (за напреднали, моля, свържете се с мен за покупка), трябва да посочите името на модела на инструмента.

Името на комплекта и

какъв комплект е бил използван за детайлите на промяната, какви специални реактиви са добавени или какви специални операции са извършени, трябва да бъдат обяснени ясно, така че другите да могат лесно да повторят вашия експеримент.

Някои хора добавят специални реактиви при извличане на специални проби, мислейки, че това е тяхното тайно оръжие и не казват на другите.Въпреки че го пазят в тайна, те също губят възможността да накарат вашата статия да блесне.Не бъди умен, трябва да си по-честен от провинциалния стар Джанг в научните изследвания, ако искаш да си умен, статията ще те направи глупав.

трябва да запомни продуктовия номер на комплектакогато поръчате комплекта и напишете статията.Обикновено има два номера на комплекта: Cat—каталожен номер (номер на продукт, номер на артикул), Lot—номер на партида на продукта (Използва се за обозначаване от коя партида идва продуктът).

В допълнение, CAS номерът често се използва при поръчка на биохимични реагенти и аз ще го популяризирам заедно.CAS номерът е номерът, даден от Американското химическо дружество на всяко ново химическо лекарство.Обикновено три числа са свързани с тире.CAS номер на Rushui: 7732-18-5.Химикалите често имат множество псевдоними, но CAS номерът е уникален.Когато поръчвате лекарство, можете първо да проверите неговия CAS номер.

По-близо до дома, защо трябва да описваме тези неща ясно?Всъщност това е и проверка на качеството на екстракцията на РНК.Използването на инструменти и комплекти ще направи извличането на РНК по-последователно.Мащабът на извличане в обикновените лаборатории не е голям и може да се получи с комплекти.

Подробности за лечението с ДНКаза или РНКаза
Важният въпрос на флуоресцентната количествена PCR е да се предотврати замърсяване на ДНК и не експериментирайте, ако има замърсяване.Следователно е наложително да посочите процеса, който сте използвали за обработка на ДНК, за да докажете, че ДНК в експерименталния процес е напълно и напълно премахната.представена чрез схематична диаграма.

Схематична диаграма на РНК и ДНК
Като цяло, методът за отстраняване на ДНК е третиране на РНК с ДНКаза след екстракция.Това обаче са сравнително стари методи.Търговските комплекти за екстракция на РНК успяха да премахнат ДНК по време на процеса на екстракция без добавяне на ДНКаза.Например серия комплекти от Foregene.

Забележка: Премахването на ДНК по време на екстракцията на РНК е много опасен нож с две остриета, който ще удължи времето на екстракция на РНК и ще увеличи риска от разграждане на РНК.По принцип това е компромис между добива на РНК и чистотата.

В допълнение, количеството DNase, добавено към адсорбционната колона на базата на силициев диоксид, е много малко и трябва да се използва висококачествена DNase, за да се постигне ефектът.Неоптимизираната ДНКаза не може да се усвои бързо и напълно.Това е тест за техническото ниво на търговеца.Разбира се, има още по-странни търговци, които се хвалят, че ДНК може да бъде премахната без ДНКаза.Може да се каже, че всеки, който се хвали, че ДНК може да бъде напълно премахната без ДНКаза, е хулиган.ДНК е относително стабилна двойноверижна структура и не може да бъде унищожена само с говорене и смях.

Оценка на замърсяването
метод за оценка: детекция чрез електрофореза, 1% агароза, 6V/cm, 15 минути, натоварване 1-3 ul

Количествен анализ на нуклеинова киселина
обикновено се измерва с помощта на UV спектрофотометър.Нека първо да популяризирам значението на трите стойности на OD260, OD280 и OD230.
·OD260nm: Това е дължината на вълната на абсорбция на най-високия пик на абсорбция на нуклеинова киселина и най-добрата измерена стойност варира от 0,1 до 1,0.Ако не, разредете или концентрирайте пробата, за да я приведете в обхвата.
·OD280nm: Това е дължината на вълната на абсорбция на най-високия пик на абсорбция на протеини и фенолни вещества.
·OD230nm: Това е дължината на вълната на абсорбция на най-високия пик на абсорбция на въглехидратите.

След това нека поговорим за ролята на всеки индикатор.За A260 може да се използва за измерване на добива на нуклеинова киселина.Когато OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, РНК=40μg/ml.

За чистота трябва да разгледаме съотношенията, които обикновено виждаме: OD260/280 и OD260/230.
· Чиста ДНК: OD260/280 е приблизително равно на 1,8.Когато е по-голямо от 1,9, това показва, че има замърсяване с РНК, а когато е по-малко от 1,6, това показва, че има замърсяване с протеини и феноли.
· Чиста РНК: 1.7
·OD260/230: Независимо дали е ДНК или РНК, референтната стойност е 2,5.Когато е под 2,0, това показва, че има замърсяване със захар, сол и органични вещества.

Целостта на РНК

Много е важно да се измери целостта на РНК.Обикновено е необходимо да се направи експеримент с гел за денатуриране на РНК, за да се провери дали яркостта между 28S и 18S РНК е двойна връзка.Когато се появи третата лента 5S, това означава, че РНК е започнала да се разгражда, с изключение на безгръбначните.

Данни за оценка на качеството на РНК: В допълнение към горните тестове има и някои по-усъвършенствани инструментални тестове по отношение на целостта на РНК, като RQI теста за цялост на системата за автоматична електрофореза Experion, която може да открие дали РНК се разгражда невидимо.

В научните изследвания флуоресцентната количествена PCR е сравнение между целевия ген и вътрешния референтен ген.Следователно, в процеса на запазване на РНК проби, екстракция на РНК и т.н., основната цел е да се гарантира целостта на РНК.

Как целостта на РНК влияе на баланса между целевия ген и вътрешния референтен ген може лесно да се разбере от фигурата по-долу.Деградацията ще доведе до непълнота на гена, независимо дали е непълнотата на вътрешния референтен ген или непълнотата на целевия ген, това ще има голямо влияние върху данните.

Схематичната диаграма на целевия ген и референтния ген не трябва да е вярна

Тест за инхибиране (дали стойността на CT е потисната при висока или ниска концентрация или други условия)

Като вземем тази фигура като пример, стойностите на Ct на петте криви са както следва.Разпределението на стойностите на CT между кривите е неравномерно и стойностите на Ct се забавят при високи и ниски концентрации, което е случаят на PCR инхибиране.

Ключов момент: В процеса на извличане на РНК трябва да изоставим погрешните схващания и да установим правилните.

Грешната идея е: екстракцията на РНК преследва само добива, мислейки, че колкото по-голямо е количеството получена РНК, толкова по-добре.Всъщност, когато правим количествено определяне, ако броят на гените не е много голям, нямаме нужда от много РНК.Количеството РНК, което извличате, е повече от достатъчно.

Правилната концепция е:Извличането на РНК трябва да преследва чистота, цялост и последователност.Чистотата може да гарантира, че последващата обратна транскрипция не е инхибирана и данните няма да бъдат засегнати от ДНК.Целостта гарантира баланса на целевите последователности и вътрешните препратки.Консистенцията осигурява стабилно зареждане на пробата.

MIQE (4) – обратна транскрипция
Погрешно схващане: стремежът към по-голям обем на извадката.
Правилна концепция: Преследвайте последователност (стабилност), независимо от количеството заредена РНК, ефективността на обратната транскрипция остава постоянна, гарантирайки, че разликите в cDNA могат наистина да отразяват разликите в иРНК.
Ние обясняваме този процес със схематична диаграма:

Схематична диаграма на ефективността на обратната транскрипция, не е вярно
На първо място, трябва да разберем разликата между процеса на обратна транскрипция и PCR процеса.PCR претърпява множество процеси на нагряване и отгряване и целевият фрагмент нараства експоненциално;докато обратната транскрипция няма този процес, можем да си представим, че обратната транскрипция всъщност е едно към едно По време на процеса на репликация, толкова много части от РНК

тъй като могат да се получат колкото се може повече части от кДНК информация, трябва да е разбрано досега, тъй като големи и малки фрагменти са били обратно транскрибирани и е невъзможно да се фокусира върху един фрагмент.И тъй като количеството на РНК е сравнително малко, количеството на получената сДНК също е сравнително малко, за разлика от PCR, която има ефект на усилване, така че по същество е невъзможно да се открие.

Резултати от cDNA електрофореза
Второ, в идеалния случай обратната транскрипция се извършва едно към едно, но никоя обратна транскриптаза от никоя компания не може да постигне този ефект.По принцип ефективността на повечето обратни транскриптази се движи между 30-50%.Ако случаят е такъв, бихме предпочели да имаме относително стабилна ефективност на обратната транскрипция, което искаме да видим на фигурата: 3 РНК получават 2 сДНК, 6 РНК получават 4 сДНК, така че без значение колко проба е заредена, ефективността на обратната транскрипция е относително стабилна.Не искаме да видим ситуацията, при която ефективността на обратната транскрипция е нестабилна и високата концентрация е инхибирана.

И така, как да проверим дали ефективността на обратната транскрипция е стабилна?Методът е много прост, трябва само да направите сравнителен тест: единият е да направите обратна транскрипция в кДНК след удвояване на РНК, а другият е да направите удвояване на разреждането след обратно транскрибиране в кДНК и след това да направите qPCR, за да видите получения наклон дали е последователен.Като отличен ученик трябва да го разберете за секунди.Както е показано по-долу:

Разреждане на РНК и кДНК, за да се провери дали ефективността на обратната транскрипция е стабилна
Обратна транскриптаза и комплект
Как перфектният флуоресцентен количествен PCR може да има отлична обратна транскриптаза и комплект.Обратната транскриптаза грубо се разделя на два вида според източника, AMV илиM-MLVи тяхната производителност е същата като тази, показана в таблицата.

РНКаза H активност
РНКаза Н е рибонуклеаза Н, китайското име е рибонуклеаза Н, която е ендорибонуклеаза, която може специфично да хидролизира РНК в хибридната верига ДНК-РНК.РНКаза Н не може да хидролизира фосфодиестерните връзки в едноверижна или двойноверижна ДНК или РНК, т.е. не може да смила едноверижна или двойноверижна ДНК или РНК.Обикновено се използва при синтеза на втората верига на кДНК.

Това е странно нещо.Ние казваме, че обратната транскриптаза има РНКаза Н активност, а не че обратната транскриптаза съдържа РНКаза Н и може да не е възможно да се отдели РНКаза Н от обратната транскриптаза, може би поради конформацията на определени групи в обратната транскриптаза. Тази активност се причинява от обратната транскриптаза.

Следователно, независимо от по-високата ефективност на обратната транскрипция на AMV, неговата активност на RNase H намалява добива на cDNA.Разбира се, производителите на реагенти непрекъснато оптимизират продуктите си, за да елиминират активността на RNase H в обратната транскриптаза, доколкото е възможно, за да увеличат добива на cDNA.
Температура на отгряване

Вторична структура на РНК при различни температури
Вижте фигурата по-горе за вторичната структура на РНК при различни температури и използвайте онлайн инструмента mFold, за да определите вторичната структура на целевия фрагмент при специфични условия на температура и концентрация на сол.При 55°C вторичната структура на РНК все още е много сложна, обратната транскриптаза не може да работи и вторичната структура не може да бъде напълно разрешена до 65°C, докато оптималната температура на AMV и M-MLV е много по-ниска от тази температура.
какво да правя?Вторичната структура е комплементарното сдвояване на самия шаблон, което води до силна конкуренция между праймера и обратната транскриптаза и шаблона, което води до поредица от проблеми като ниско Е и лоша повторяемост.

какво да правя?Увеличете само температурата на отгряване колкото е възможно повече.

Много производители на реагенти подобряват своята обратна транскриптаза чрез генно инженерство.Някои повишават реакционната температура, като Jifan и Aidelai, а някои премахват активната група на RNase H ензима, за да подобрят афинитета между ензима и RNA шаблона.Високият афинитет може конкурентно да изтръгне вторичната структура и да се прочете гладко, а също така значително да подобри ефективността на обратната транскрипция.
Ключов момент: Обратната транскрипция е по-важна за преследване на последователността на ефективността на обратната транскрипция (ензимите трябва да бъдат не само ефективни, но и стабилни), отколкото количеството на заредената проба, ако не е особено широкомащабна флуоресцентна количествена PCR, няма да е възможно изобщо.Множество cDNA.
Различни производители също са положили известни усилия в преследването на последователност.Например, повечето компании вече са пакетирали обратната транскрипция като стандартен комплект за продажба, което е добър избор.
Например комплектите RT Easy Series на Foregene:

RT Easy I (Главен премикс за комплект за синтез на първа верига cDNA)

MIQE (5) – информация за целевия ген

Горната фигура обяснява
1. Дали този ген е ефективен за повтарящи се експерименти обикновено може да се провери чрез повторни експерименти.
2. Gene ID, нали знаете.
3. Дължина на гена, общата дължина на целевия ген определено не е проблем.Когато проектирате праймери, уверете се, че дължината на ампликона е между 80-200 bp, за да осигурите по-добра ефективност на амплификацията.
4. Информация за сравнение на секвенция Blast, целевият ген трябва да бъде сравнен в генна банка, за да се предотврати неспецифична амплификация.
5. Наличие на псевдогени.Псевдогенът е ДНК последователност, подобна на нормален ген, но губи нормалната си функция.Често съществува в мултигенното семейство на еукариотите.Обикновено се представя с ψ.Това е нефункционално копие на геномна ДНК в генома, което е много подобно на последователността на кодиращия ген., обикновено не се транскрибират и нямат ясно физиологично значение.
6. Позиция на праймерите спрямо екзони и интрони.В ранните години, когато решихме проблема с ДНК замърсяването, често обръщахме внимание на позициите на праймери, екзони и интрони и като цяло обмисляхме проектиране на праймери в интрони, за да избегнем ДНК амплификация.Моля, вижте фигурата по-долу: черното представлява интрони, различните сини представляват екзони, розовото представлява общи праймери, а яркочервеното представлява праймери, обхващащи интрони.

Схематично, никога вярно
Какъв перфектен план изглежда това, но всъщност в повечето случаи транс-интронните праймери не са толкова магически, колкото си представят, и те също ще причинят неспецифично усилване.Така че най-добрият начин да се предотврати заразяване с ДНК е пълното премахване на ДНК.
7. Предсказване на конформацията.Използвайки отново този пример, използвайте онлайн инструмента mFold, за да определите вторичната структура на целевия фрагмент при определена температура и концентрация на сол.

Вторична структура на РНК при различни температури
Вторичната структура е комплементарното сдвояване на самия шаблон, което ще доведе до силна конкуренция между праймера и сдвояването на шаблона и шансовете за свързване на праймера са по-малки, което води до поредица от проблеми като ниско Е и лоша повторяемост.Чрез софтуерно прогнозиране, ако няма проблем с вторичната структура, това би било чудесно.Ако има, нашата последваща статия ще обсъди конкретно как да разрешите този проблем.

MIQE (6)—qPCR олигонуклеотиди

За флуоресцентна количествена PCR, първото нещо, с което се борите всеки ден, е извличането на РНК, а второто нещо може да бъде дизайнът на праймера.
На първо място, ние все още проверяваме правилата за дизайна на грунда според списъка за проверка на MIQE.Толкова е просто, че мръсниците могат да се смеят, а ние можем да го завършим с едно изречение: разберете последователността и позицията на праймерната сонда и метода на модификация.За метода за пречистване на праймера, синтезът на праймера е толкова евтин в момента, qPCR е достоен за PAGE и по-горе методи за пречистване и информацията на инструмента за синтез не е важна.Много хора правят грундове от десетилетия и не знаят, че синтезаторът е ABI3900.
Що се отнася до принципите на проектиране на буквари, не е нужно да ги запомняте наизуст, защото повечето софтуери за проектиране на буквари или онлайн инструменти могат да се погрижат за тези проблеми (препоръчителен онлайн инструмент primer3.ut.ee/), а 99,999% от проектирането на буквари не се прави ръчно Вижте, авторът понякога проектира стотици буквари на ден, ако четете един по един, ще стане кривоглед.
Просто проверете следните точки, след като праймерите са проектирани:
1. Проектирайте праймери близо до 3' края: В случай на използване на олиго dT праймери за синтез на първата верига на кДНК, като се има предвид ефективността на обратната транскрипция и целостта на РНК, проектираните праймери трябва да бъдат проектирани близо до 3' края, за да се подобри ефективността на амплификацията.Използвайте снимка, за да обясните следното (няма начин да разберете това):

Защо праймерите трябва да бъдат проектирани близо до 3′ края, трябва да не е вярно
2. TM стойност: Tm стойността е при 55-65°C (тъй като екзонуклеазната активност е най-висока при 60°C), а съдържанието на GC е 40%-60%.
3. BLAST: За да се избегне неспецифична амплификация на генома, Blast трябва да се използва за допълнителна проверка.

MIQE(7)—qPCR процес

1. qPCR комплект
Съгласно изискванията на MIQE трябва ясно да опишем пълните реакционни условия в статията, включително конфигурацията на PCR реакционната система, какъв комплект се използва, кой е производителят, колко голяма е реакционната система, дали се използва методът на багрилото или методът на сондата, настройките на PCR програмата.Ветераните шофьори определено ще открият, че докато комплектът е избран, горната информация е основно определена.
Понастоящем производството и производството на флуоресцентни количествени PCR комплекти е много зряла технология.Стига да не изберете изключително лоши производители, вероятността от проблеми не е голяма, но все пак искаме да споделим с вас няколко точки:
Ензим Taq с горещ старт:Най-важната част от PCR е ензимът Taq с горещ старт.Ензимите за горещ старт на пазара обикновено се разделят на два вида, единият е химически модифициран ензим за горещ старт (можете да си го представите като вграждане във парафин), а другият е ензим за горещ старт за модификация на антитела (свързване на антиген-антитяло).Химическата модификация е ранен начин за горещо стартиране на ензими.Когато се достигне определена температура, ензимът ще освободи своята активност.Модифицираният с антитяло ензим за горещ старт използва биологични методи за блокиране на активността на ензима.Когато се достигне определена температура, антитялото ще бъде денатурирано и инактивирано като протеин и ензимната активност ще бъде активирана.

Но каква е ползата от това?Това е така, активността на освобождаване на модифицираните с антитяло ензими е по-бърза от тази на химически модифицираните ензими, така че по отношение на чувствителността, модифицираните с антитела ензими имат леко предимство, така че по същество няма химически модифицирани ензими в комплектите на пазара.Ако има, тогава технологията на този производител все още е заседнала в ерата на хилядолетието.
Концентрация на магнезиевите йони:Концентрацията на магнезиевите йони е много важна при PCR реакцията.Подходящата концентрация на магнезиевите йони може да насърчи освобождаването на активността на ензима Taq.Ако концентрацията е твърде ниска, ензимната активност ще бъде значително намалена;ако концентрацията е твърде висока, ензимно-катализираното неспецифично усилване ще се засили.Концентрацията на магнезиеви йони също ще повлияе на отгряването на праймерите, температурата на топене на матрицата и PCR продуктите, като по този начин ще повлияе на добива на амплифицирани фрагменти.Концентрацията на магнезиеви йони обикновено се контролира при 25 mM.Разбира се, за добър комплект, концентрацията на магнезиеви йони трябва да бъде добре контролирана.Някои търговци добавят магнезиев йон хелатиращ агент към реагента, който може да постигне ефекта на автоматично регулиране на концентрацията на магнезиевите йони.
Концентрация на флуоресцентно багрило:Флуоресцентното багрило, което е SYBR Green, което обикновено използваме, основно генерира флуоресценция чрез свързване към малката бразда на двойноверижна ДНК, тъй като свързването на багрилото към двойноверижна ДНК е неспецифично, т.е. докато двойноверижната ДНК се комбинира с нея, може да възникне флуоресценция, така че праймерите-димери и ДНК шаблоните в системата ще се комбинират с нея, за да образуват фонов сигнал .
PS: Поради своите светлочувствителни свойства, продуктите на пазара обикновено са опаковани в кафяви непрозрачни центрофужни епруветки (както е показано на снимката по-долу).Това обаче ще срещне проблем.Трудно е да се види дали течността е засмукана при вземане на проба.В това отношение Qingke наистина е най-удобният за потребителя (както е показано на снимката по-долу), а прозрачната тръба е опакована в непрозрачна тенекиена торбичка.След това го поставете в тенекиена торбичка, като вземете предвид удобството да избягвате светлина и вземане на проби.Трябва да изберете правилния номер на продукта.TSE204 е супер рентабилно съществуване, което ме кара да искам да садя трева.

Концентрацията на флуоресцентното багрило също е много важна.Ако концентрацията е твърде ниска, кривата на усилване няма да се повиши на по-късен етап и не е перфектна;ако концентрацията е твърде висока, това ще причини шумови смущения.Тъй като флуоресцентната количествена PCR зависи главно от стойността на CT, ако концентрацията на флуоресцентното багрило не е регулирана правилно, ниската точка е по-добра от високата точка.Разбира се, подходящата концентрация на багрилото е най-добрата.

ROX: ROX багрилата се използват за коригиране на грешки на флуоресцентния сигнал от ямка до ямка.Някои производители на инструменти изискват калибриране, докато други не.Например, използването на инструмента за PCR амплификация в реално време на Thermo Fisher Scientific обикновено изисква калибриране, включително 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus и т.н. Общите инструкции за комплекта ще го опишат.
qPCR Mix на Foregene също съдържа ROX багрило, което е удобно за използване в различни модели.

PCR комплект в реално време-Taqman

Третиране на слаба водородна връзка: Третирането на слабите водородни връзки е сравнително технически въпрос.Нищо не е чел ръководствата на много комплекти, но никой от тях не спомена тази тема.Всъщност е толкова важно.Комбинацията от бази зависи главно от силата на водородните връзки.Силните водородни връзки са нормално усилване, а слабите водородни връзки водят до неспецифично усилване.Ако слабите водородни връзки не могат да бъдат елиминирани добре, неспецифичното усилване не може да бъде избегнато.В обхвата на автора само няколко компании са забелязали този проблем.Когато купувате комплекта, можете да се обърнете към това дали сте обмисляли решение в това отношение за комплекта, който искате да изберете.

Реакционен обем: Системата 20-50 ul се използва по-често и по-малките обеми вероятно ще причинят грешки.Най-общо казано, инструкциите на комплекта ще препоръчат използването на PCR реакционни обеми.Не бъдете умни и използвайте по-малки обеми, за да спестите разходи.целта на.Обемът, препоръчан от търговците, всъщност е тестван и може да се окаже, че те не могат да решат проблема с грешките, причинени от малки обеми.
2. Производителят и артикулният номер на тръбната плоча
Всеки знае принципа на флуоресцентната количествена PCR.Събирането на флуоресценция се извършва главно чрез капачки на PCR епруветки.Когато избирате консумативи за PCR, обърнете внимание на две точки: добро пропускане на светлина и подходящо за инструмента.Най-общо казано, платките и тръбите на масовите марки са добри, но трябва да избирате внимателно по отношение на адаптацията, в противен случай няма да можете да използвате инструмента.

4. Знания на най-високо ниво

MIQE (8)—qPCR валидиране
Това е основният приоритет на qPCR!Толкова много герои са паднали в пясъка тук.Разбира се, възможно е също така да имате късмет и гените, които сте изучавали, да са прости, така че да сте се носили през ледената пещера по вятъра.Информацията за проверка на qPCR има за цел да тества надеждността на данните.Ние изброяваме необходимата информация за проверка, както следва:

1. Тест за специфичност
Специфичността на амплификацията на целевия ген се тества чрез проверка дали картината на електрофорезата е единична лента;проверка на последователността;крива на топене, за да видите дали пиковата карта е единична;проверка на храносмилането на ензими и други методи.
Тук се фокусираме върху tанализ на неспецифичното усилване с помощта на метода на кривите на топене.Най-общо казано, когато проектираме праймери, се изисква размерът на продуктовия фрагмент да бъде в диапазона 80-200 bp, което прави температурата на топене на PCR продукта в диапазона 80-85 °C.Следователно, ако има различни пикове, трябва да има други неспецифични продукти на усилване;ако пикът се появи под 80°C, обикновено се счита, че това е праймер димер;ако пикът се появи над 85°C, това обикновено се счита за ДНК замърсяване или по-неспецифична амплификация на големи фрагменти.
Забележка: Понякога има само един пик при 80°C.В този момент тази концепция трябва да се спазва.Вероятно резултатите от амплификацията са всички димери на праймера.

Нормална крива на топене (единичен пик без неспецифично усилване)

Проблемна крива на топене (неспецифично усилване на фалшиви пикове)
【Анализ на случай】

Има основен пик, но основният димер е сериозен
Кривата на топене с един връх на фигурата по-долу може лесно да заблуди очите ви, като си помислите, че е перфектен експеримент, но резултатът е напълно грешен.По това време трябва да погледнем температурата на топене.Пиковата температура е под 80°C, което е напълно грунд-димер.

Няма целеви фрагмент, всички димери на праймера
Ето, брат ми не може да спре.Снимката по-долу е снимка, направена с мобилен телефон, изпратена ми от един мръсник.Всички реактиви, които използва, са често използвани марки в индустрията.Той смени една марка с Т-префикс на друга марка с Т-префикс.Мисля, че вече се досетихте.Мръсникът ми извика: „Реактивът, използван на първата снимка, е твърде добър, а пикът е единичен.По-късно, след използване на препоръчания от вас реагент, става като на втората снимка, със смесени пикове.Ти ме направи нещастен.“
Разделете двете графики.На пръв поглед единият е с единичен връх, а другият с двоен връх.Глупости, един връх, разбира се, е добре.Вярно ли е?
По-лошо от Dou E, ако сложа двете снимки на снимката по-долу, веднага ще разберете.Всъщност ние лесно се парализираме от този вид картина.След внимателен анализ открихме, че: пикът на първата цифра е при 75°C, което е напълно праймерен димер;пикът на втората фигура се появява при 75°C и 82°C, поне има Продуктът се появява.

Снимки на обратна връзка от ученици
Така че основният проблем не е проблемът с реагентите, а проблемът с дизайна на праймера.В същото време това също доказва, че някои големи марки не са с качество на желязото, и също така доказва това, което брат ми каза преди: Не марката реагент подкрепя вашата статия.Вашата статия подкрепи марката реактиви.Само си представете, ако мръсникът не промени реагентите, грешните данни ще бъдат изпратени в журнала и това, което ще се случи, ще бъде трагедия.
2. Ct стойност на празна контрола
Не обяснявайте, ако празната контрола има стойност на Ct, не е ли замърсяване?Все пак трябва да разберете коя празна контрола има стойност Ct.Ако е NTC, това означава, че има чужда ДНК, като например замърсяване с реагент.Ако е NRT, това означава, че извлечената РНК има ДНК замърсяване.
3. Стандартна крива
Включително наклона и формулата за изчисление, ефективността на PCR може да се изчисли чрез формулата.Перфектният експеримент изисква наклонът на стандартната крива да се доближи до 3,32, а R² да се доближи до 0,9999.
4. Линеен динамичен диапазон
Динамичният диапазон на реакцията е линеен.Според шаблона, използван за генериране на стандартната крива, динамичният диапазон трябва да включва най-малко 5 градиента на концентрация и да се обърне внимание на промяната на стойностите на Ct при градиенти на висока концентрация и градиенти на ниска концентрация.
5. Точност на откриване
Промените в резултатите от qPCR, тоест лошата повторяемост, тоест лошата прецизност, са причинени от много фактори, включително температура, концентрация и работа.Прецизността на qPCR обикновено става по-малко контролируема, тъй като броят на копията намалява.В идеалния случай в рамките на експерименталната вариация, тази техническа вариация трябва да се различава от биологичната вариация и биологичните реплики могат директно да адресират статистическите разлики в резултатите от qPCR между групите или леченията.По-специално за диагностични анализи, трябва да се докладва най-добрата прецизност между анализите (повторяемост) между сайтовете и операторите.
6. Ефективност на откриване и LOD (в мултиплексна qPCR)
LOD е най-ниската концентрация от 95% от откритите положителни проби.С други думи, концентрацията на LOD, съдържаща се в набор от реплики на целеви гени, не трябва да надвишава 5% от неуспешните реакции.Когато се извършва мултиплексен qPCR анализ, особено за едновременно откриване на точкови мутации или полиморфизми, мултиплексният qPCR трябва да предостави доказателство, че точността на множество целеви фрагменти не е компрометирана в една и съща епруветка, многократно откриване и откриване на една епруветка Ефективността и LOD трябва да са еднакви.Особено когато целевите гени с висока концентрация и целевите гени с ниска концентрация се усилват едновременно, на този проблем трябва да се обърне внимание.
Проблеми и решенияНай-общо казано, често срещаните проблеми при qPCR отстраняване на грешки се фокусират върху следните аспекти:
·неспецифично усилване
·Труден избор на концентрация на праймер и проблеми с праймери-димери
·Температурата на отгряване е неточна
·Вторичната структура влияе върху ефективността на усилване
неспецифично усилване
неспецифично усилванесе случи, обикновено се преценява дали дизайнът на праймера не е подходящ, но ако не бързате да сменяте праймерите, можете първо да опитате следните методи (принципът също е приложен):
· Увеличете температурата на отгряване – опитайте се да направите слабите водородни връзки неспособни да се поддържат;
·Скъсяване на времето за отгряване и удължаване – намалява вероятността от слаби водородни връзки;
·Намалете концентрацията на праймера – намалете шанса за свързване на излишни праймери и нецелеви региони;
Ниска ефективност на усилване
Обратната ситуация на неспецифичното усилване – ниска ефективност на усилване, а мерките за справяне с ниската ефективност на усилване са точно обратното:
· Удължаване на времето за отгряване и удължаване;
· Промяна към триетапна PCR и намаляване на температурата на отгряване;
·Увеличете концентрацията на праймера;
Ps: Много студенти, родени през 90-те, не желаят да учат как да отстраняват грешки в експерименти и се надяват, че комплектът може напълно да реши проблема (ако искате да отидете в компания за реактиви, за да правите изследвания и разработки след дипломирането), всъщност производителите на реагенти също мислят по този начин, надявам се, че е глупаво. Може да се използва, когато го получите, така че производителите на реагенти са похарчили много усилия, за да решат проблема с неспецифичното усилване, включително въвеждането на слаб H-bon d фактори на усвояване.За лесно решаване на проблема, глупаците все още трябва да прочетат въведението на компанията за реагенти, за да видят дали има фактор, който абсорбира слабите водородни връзки.
Труден избор на концентрация на праймер и проблеми с праймери-димери
Метод 1: Най-общо казано, инструкциите на комплекта за qPCR съдържат препоръчани системи и препоръчителни концентрации на праймера.
Метод 2: Отстраняване на грешки чрез задаване на градиента на концентрация на праймера.Картината по-долу е открадната от компания за илюстрация.Фигурата по-долу показва количествените резултати от флуоресценцията, получени с три концентрационни градиента на праймера (100 nM, 250 nM, 500 nM) и четири шаблонни концентрационни градиента (0,1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng).Стойността на Ct на експерименталните резултати се изобразява, както следва:

Избор на концентрация на праймер Свържете всяка концентрация на праймер в ред, както следва:

Изборът на концентрация на праймера е очевиден, линейната зависимост на концентрацията на праймера от 100 nM и 250 nM е по-добра, а линейната връзка на концентрацията на праймера от 500 nM е относително лоша.При 100nM и 250nM стойността на Ct от 250nM е сравнително малка, така че оптималната концентрация на праймера е 250nM.Като цяло тежки праймери-димери могат да се видят в кривата на топене.Ами ако проектираните праймери не могат да избегнат праймери-димери?
Метод 3: Намалете количеството на праймерите и увеличете температурата на отгряване (няма нужда от обяснение).
Емпиричната стойност на температурата на отгряване е 60°C.Ако не сте сигурни, как да изберете по-подходяща температура на отгряване?Отговорът е същият като избора на концентрация на праймера –градиентен тест.Направете снимка от компанията Bio-rad, за да илюстрирате проблема.За амплификацията на определен целеви фрагмент задайте осем температурни градиента, всеки с три повторения, като получената крива на амплификация е следната:

избор на температура на отгряване:
·70°C, 69°C—По принцип праймерите не могат да се комбинират, така че няма усилване.
·67,3°C – Има малко усилване в началото и стойността на Ct е относително голяма.
·64,5°C——Стойността на Ct намалява.
·При 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C и 55,0°C стойностите на Ct като цяло са стабилни, но крайните стойности на флуоресценция са различни.
Как да изберем?Принцип: Първият принцип е по-високата стойност на Ct.За същата стойност на Ct изберете по-висока температура на отгряване, за да избегнете димеризация и неспецифично усилване.Въпреки че има по-висока стойност на флуоресценция при 55°C, в нея може да има димери или неспецифично усилване.
Но ако сте умни като вас, определено ще си помислите: Логично погледнато, ако PCR реакцията е много специфична, докато концентрацията на праймера надвишава минималното изискване, високите и ниските точки не би трябвало да имат ефект, точно както флуоресцентните багрила и dNTP.Наистина, докато температурата на отгряване е оптимизирана правилно, ефектът от концентрацията на праймера върху стойността на Ct естествено ще бъде сведен до минимум.

Температурата на отгряване е оптимизирана правилно и ефектът от концентрацията на праймера върху CT ще бъде сведен до минимум
Вторичната структура влияе на ефективността на усилване
Нека вземем снимката от Bio-rad, за да илюстрираме проблема.Той също така проектира температурен градиент за усилване на ген с вторична структура.

Появява се вторична структура
Може да се види, че когато температурният градиент намалява, започват да се появяват продукти и стойността на Ct се движи напред, достигайки минималната стойност при 60,7°C, а след това, когато температурният градиент намалява, стойността на Ct става по-голяма.Обратно, с повишаване на температурата вторичната структура се отваря и ефективността на усилване се увеличава.След достигане на определена температура повишаването на температурата не може да подобри ефективността на усилване.Тъй като праймерите не могат да бъдат стабилно комбинирани в този момент.Следователно,потърсете температурата с най-ниска стойност на Ct, което е най-добрата температура за усилване на шаблона на вторичната структура!Разбира се, умните глупаци трябва да знаят, че ако не е необходимо, най-добре е да смените праймерите и да избягвате областта на вторичната структура.
5. Ниво на приложение
MIQE—Анализ на данни

Анализът на данните се дава главно от флуоресцентен количествен PCR инструмент.В предишната статия беше извършена много работа по анализ на данни, като празната контрола, която беше обяснена в дизайна на експеримента.Изяснени са вътрешните референтни гени, повторните числа и т.н., тук основно обясняваме приложението на qPCR.
qPCR се използва широко, а експерименталната проверка и диагностиката на нуклеинова киселина са най-често използваните сценарии.
абсолютно количествено определяне
Log (първоначалната концентрация) има линейна връзка с броя на циклите.Стандартна крива може да бъде начертана от стандарт с известен начален номер на копие, т.е. може да се получи линейната зависимост на реакцията на усилване.Според стойността на Ct на пробата може да се изчисли концентрацията в пробата.Количеството шаблони за включване.

Метод на абсолютно количествено изчисление
Абсолютното количествено определяне трябва да се основава на стандартната крива.За да направите стандартна крива, е необходим стандарт.Обикновено стандартът е плазмид, получен чрез клониране на целевия ген.Защо е плазмид?Тъй като кръговата плазмидна ДНК е най-стабилна.Разредете стандартния продукт в 5 до 6 градиента според съотношението на удвояване (10-кратно разреждане) и обърнете внимание на еднородността при разреждане.Нека стойността на Ct падне между 15-30.

Стандартна подготовка
В същото време пробата, която ще се тества, също трябва да бъде съответно разредена (запомнете фактора на разреждане), а стойността на Ct също трябва да пада между 15-30.Стандартният продукт + пробата за тестване се поставят на машината заедно.След цикъла се прави стандартна крива със стандартното вещество и пробите, които трябва да бъдат тествани, се поставят в стандартната крива, за да се изчисли концентрацията.
Количественото определяне на HBV вируса на хепатит B е типично абсолютно количествено определяне, което може да изчисли броя на копията на вируса в 1 ml кръв.
Изчисляване на броя на копията
Концентрация на пробата за тестване (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × фактор на разреждане
Молекулно тегло на пробата = брой бази × 324
Броят на копията на пробата, която ще се тества (копия/ul) = концентрацията на пробата, която ще се тества / молекулното тегло на пробата × 6 × 1014

Метод за изчисляване на броя на копията

По-горе е методът на изчисление за определяне на количеството.Това е математическа задача, която може да се реши след завършване на прогимназията, а математическите задачи обикновено се решават с компютри.Ако не разбирате, можете да дойдете да общувате.
относително количествено определяне
Относителното количествено определяне се използва главно в научните изследвания.Колко вируса има в 1 ml кръв и това е ДНК вирус, това е относително детерминистично събитие: количеството кръв може да се определи и ДНК вирусът е относително стабилен.За нас обаче е трудно да сравним броя на транскрипционните копия на определен ген в лист, тъй като е трудно да се определи размерът, теглото и нежността на листа, количеството извлечена РНК е трудно за определяне и ефективността на обратната транскрипция също е трудна за определяне, тоест всяка стъпка може да накара експерименталните данни да имат грешки и да не могат да бъдат използвани.
Следователно относителното количествено определяне трябва да въведе елемент:вътрешният референтен ген.
С други думи, относителното количествено определяне всъщност е сравнение между целевия ген и вътрешния референтен ген.Сравнено в същата тъкан и същата клетка, влиянието на размера на пробата, количеството на екстракцията на РНК, ефективността на обратната транскрипция и ефективността на PCR е сравнително малко.Поради малкия размер на извадката, както вътрешните референтни гени, така и целевите гени бяха относително намалени.Ето защо и преди наблягахме на еднообразието и стабилността.
Вътрешните референтни гени обикновено садомакински гени(гени за домакинство), които се отнасят до клас гени, които са стабилно експресирани във всички клетки и техните продукти са необходими за поддържане на основните жизнени дейности на клетките.
Не бъркайте това понятие.Домакинските гени са термини за биологична функция, докато вътрешните референтни гени са експериментални технически термини.Гените за домакинство трябва да преминат валидиране, преди да могат да бъдат избрани като вътрешни референтни гени.
Например, ние избрахме няколко домакински гена на фигурата по-долу, за да тестваме техните нива на експресия в различни тъканни клетки, и открихме, че нивата на експресия на β-2-микроглобулин са доста различни от тези на другите три гена, така че те не могат да бъдат използвани като вътрешни референтни гени.

След разбиране на коригиращата функция на вътрешния референтен ген, се извеждат два алгоритъма поради въвеждането на вътрешния референтен ген.
·метод на двойната стандартна крива
·2 – △△Ct метод (метод за сравнение на CT стойности)
Ако се интересувате от изучаване на функциите на видовете и гените, моля, откажете се от изследването на алгоритми и използвайте директно формули или директно използвайте машини;ако сте прям човек в математиката и инженерството, моля, не се колебайте.
метод на двойна стандартна крива
Определете количествено целевия ген и гена за домакинство на контролната проба и пробата, която ще се тества чрез стандартната крива, и след това изчислете относителната стойност според формулата за изчисление, която е относителното ниво на експресия.
Предимства: прост анализ, сравнително проста експериментална оптимизация
Недостатък: За всеки ген всеки кръг от експерименти трябва да направи стандартна крива
Приложение: Един от двата най-често използвани и признати относителни количествени методи в изследването на регулацията на генната експресия
Формулата е следната:

Примерите са както следва:

Изчислете относителното количество въз основа на количествения резултат
2 – △△Ct метод (CT метод за сравнение на стойности)

Предимства: Няма нужда да правите стандартна крива
Недостатъци: Предполага се, че ефективността на усилване е близо до 100%;стандартното отклонение е < 5%, а стандартната крива и ефективността между всяко усилване се приемат за последователни;оптимизирането на експерименталните условия е по-сложно.
Приложение: Един от двата най-често използвани и признати относителни количествени методи в изследването на регулацията на генната експресия

Разбира се, ефективността на усилване обикновено е невъзможно да бъде идеално 1. Метод на корекция: Ако знаем, че целевият ген и референтният ген имат една и съща ефективност на усилване, но ефективността на усилване не е равна на 1, тогава 2－△△Ct може да се коригира като: (1+E )－△△Ct, например, ако ефективността на усилване е 0,95, тогава формулата за изчисление може да бъде коригирана на 1,9 5－△△Ct
Досега съдържанието за флуоресцентна количествена PCR е приключило.