Няма сигнали за усилване

1. Taq ДНК полимеразата в комплекта губи своята активност поради неправилно съхранение или изтичане на срока на годност на комплекта.
Препоръка: Потвърдете условията за съхранение на комплекта;добавете отново подходящо количество Taq ДНК полимераза към PCR системата или закупете нов комплект PCR в реално време за свързани експерименти.

2. Има много инхибитори на Taq ДНК полимераза в ДНК шаблона.
Предложение: Пречистете шаблона или намалете количеството използван шаблон.

3. Концентрацията на Mg2+ не е подходяща.
Препоръка: Концентрацията на Mg2+ на 2× Real PCR микс, който предоставяме, е 3,5 mM.Въпреки това, за някои специални праймери и шаблони, концентрацията на Mg2+ може да бъде по-висока.Следователно можете директно да добавите MgCl2, за да оптимизирате концентрацията на Mg2+.Препоръчва се увеличаване на Mg2+ с 0,5 mM всеки път за оптимизация.

4. Условията на PCR амплификация не са подходящи и последователността на праймера или концентрацията е неправилна.
Предложение: потвърдете правилността на последователността на праймера и праймера не е бил разграден;ако сигналът за усилване не е добър, опитайте да понижите температурата на отгряване и регулирайте концентрацията на праймера по подходящ начин.

5. Количеството шаблон е твърде малко или твърде много.
Препоръка: Извършете градиентно разреждане на линеаризация на шаблона и изберете концентрацията на шаблона с най-добър PCR ефект за PCR експеримент в реално време.

NTC има твърде висока стойност на флуоресценция

1.Замърсяване с реагент, причинено по време на работа.
Препоръка: Заменете с нови реагенти за PCR експерименти в реално време.

2. Възникнало е заразяване по време на подготовката на PCR реакционната система.
Препоръка: Вземете необходимите предпазни мерки по време на работа, като: носене на латексови ръкавици, използване на накрайник за пипета с филтър и др.

3. Праймерите се разграждат и разграждането на праймерите ще причини неспецифично усилване.
Предложение: Използвайте SDS-PAGE електрофореза, за да откриете дали праймерите са се разградили и ги заменете с нови праймери за PCR експерименти в реално време.

Праймер димер или неспецифична амплификация

1. Концентрацията на Mg2+ не е подходяща.
Препоръка: Концентрацията на Mg2+ на 2× Real PCR EasyTM Mix, която предоставяме, е 3,5 mM.Въпреки това, за някои специални праймери и шаблони, концентрацията на Mg2+ може да бъде по-висока.Следователно можете директно да добавите MgCl2, за да оптимизирате концентрацията на Mg2+.Препоръчва се увеличаване на Mg2+ с 0,5 mM всеки път за оптимизация.

2. Температурата на PCR отгряване е твърде ниска.
Предложение: Повишавайте температурата на отгряване на PCR с 1℃ или 2℃ всеки път.

3. PCR продуктът е твърде дълъг.
Препоръка: Дължината на PCR продукта в реално време трябва да бъде между 100-150 bp, не повече от 500 bp.

4. Праймерите се разграждат и разграждането на праймерите ще доведе до появата на специфично усилване.
Предложение: Използвайте SDS-PAGE електрофореза, за да откриете дали праймерите са се разградили и ги заменете с нови праймери за PCR експерименти в реално време.

5. PCR системата е неправилна или системата е твърде малка.
Предложение: Системата за реакция на PCR е твърде малка, което ще доведе до намаляване на точността на откриване.Най-добре е да използвате реакционната система, препоръчана от количествения PCR инструмент за повторно провеждане на PCR експеримента в реално време.

Лоша повторяемост на количествените стойности

1. Инструментът не функционира добре.
Предложение: Може да има грешки между всеки PCR отвор на инструмента, което води до лоша възпроизводимост по време на управление на температурата или откриване.Моля, проверете според инструкциите на съответния инструмент.

2. Чистотата на пробата не е добра.
Препоръка: Нечистите проби ще доведат до лоша възпроизводимост на експеримента, което включва чистотата на шаблона и праймерите.Най-добре е шаблонът да се пречисти, а праймерите се пречистват най-добре чрез SDS-PAGE.

3. Времето за подготовка и съхранение на PCR системата е твърде дълго.
Предложение: Използвайте PCR системата в реално време за PCR експеримент веднага след приготвянето и не я оставяйте настрана твърде дълго.

4. Условията на PCR амплификация не са подходящи и последователността на праймера или концентрацията е неправилна.
Предложение: потвърдете правилността на последователността на праймера и праймера не е бил разграден;ако сигналът за усилване не е добър, опитайте да понижите температурата на отгряване и регулирайте концентрацията на праймера по подходящ начин.

5. PCR системата е неправилна или системата е твърде малка.
Предложение: Системата за реакция на PCR е твърде малка, което ще доведе до намаляване на точността на откриване.Най-добре е да използвате реакционната система, препоръчана от количествения PCR инструмент за повторно провеждане на PCR експеримента в реално време.