Escherichia coli O157:H7 Комплект за откриване на нуклеинова киселина (метод на PCR флуоресцентна сонда)
Описание на комплекта:
Кат.№FP102
Използва се за бързо откриване и скрининг на Е. coli O157:H7 в проби от храни, фуражи, вода и проби от околната среда.
Описания
Използва се за бързо откриване и скрининг на Е. coli O157:H7 в храни, фуражи, водни проби и проби от околната среда.
[Принцип на тестване]Съгласно принципа на флуоресцентната PCR технология, специфични праймери и сонди Taqman са проектирани за специфичния ген на Escherichia coli O157: H7 и се откриват от флуоресцентен PCR инструмент, така че да се реализира откриването на Escherichia coli O157: H7 Качествено откриване на ДНК.
Съдържание на комплекта
Забележка: Сондата за ROX канал не е включена.
| Cкомпоненти | Спецификация | Quantity |
| Буфер А | тръба | 1 |
| Буфер Б | тръба | 1 |
| Положителна контрола | тръба | 1 |
| Отрицателна контрола | тръба | 1 |
Очаквана употреба
Използва се за бързо откриване и скрининг на Е. coli O157:H7 в проби от храни, фуражи, вода и проби от околната среда.
Условия за съхранение и срок на годност
Съхранявайте при -20℃ на тъмно и избягвайте повторно замразяване и размразяване.
Срокът на валидност е 12месеца, а датата на производство е посочена върху външната опаковка.
Инструменти и консумативи
Флуоресцентен количествен PCR инструмент, пистолет за пипета и съвпадащи накрайници, вихров шейкър, миницентрофуга.
Използване
1. Обработка на проби
1.1 Тип проба: Този комплект е подходящ за проби от храни, фуражи, вода и други проби, за които се подозира, че са заразени с Escherichia coli O157:H7.За дълбоко преработени месни продукти, напитки и други вещества, съдържащи пигменти, те трябва да бъдат изплакнати, за да се избегне повлияване на събирането на флуоресцентен сигнал.
1.2 Обработка на пробите: Вижте „GB 4789.10-2016 Национален стандарт за безопасност на храните, микробиологично изследване на храните на Escherichia coli O157: H7 Тест“ за подготовка на пробите, култура за обогатяване и изолиране на Escherichia coli O157: H7.
- Nекстракция на нуклеинова киселина
Вземете 20 mL от разтвора за обогатяване в 1,5 mL центрофужна епруветка, добавете 200 μL микробен лизат (необходим е допълнителен комплект), разбъркайте за 30 секунди, центрофугирайте за кратко и оставете настрана.
Забележки: Извличането на нуклеинова киселина от лизата трябва да бъде завършено в рамките на 10 минути и не може да се съхранява дълго време.
3. Амплификация на нуклеинова киселина
3.1 Включете флуоресцентния количествен PCR инструмент за използване.
Буфер A и буфер B от комплекта, разтопете ги старателно и центрофугирайте за кратко.Добавете 18 μL буфер A и 2 μL буфер B към всяка PCR реакционна епруветка.След това добавете по 5 mL всяка от отрицателната контрола, екстрахираната нуклеинова киселина и положителната контрола в епруветките за PCR реакция, покрийте епруветките и центрофугирайте за кратко.
3.3 Прехвърлете PCR реакционната епруветка във флуоресцентна PCR машина и използвайте следните процедури за извършване на експерименти за амплификация: изберете 25 mL за реакционната система, съберете флуоресцентни сигнали при 60°C за всеки цикъл и изберете FAM за канала за откриване.
| стъпка | програма | Брой цикли |
| 1 | 37℃ 5мин | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 мин | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60℃ 30s (събиране на флуоресценция) |
Ръководства за анализ на проблеми
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Не може да се извлече РНК или добивът на нуклеинова киселина е нисък
Обикновено има много фактори, които влияят върху ефективността на възстановяването, като: съдържание на РНК в пробата, метод на работа, обем на елуиране и др.。
Анализ на често срещаните причини:
1. Ледена баня или центрофугиране при ниска температура (4 ° C) по време на работа.
Предложение: Работа при стайна температура (15-25 °C), никога ледена баня и нискотемпературна центрофуга.
2. Неправилно съхранение на пробата или твърде дълго съхранение на пробата.
Предложение: Съхранявайте пробите при -80 °C или замразявайте в течен азот и избягвайте многократно използване при замразяване-размразяване;опитайте се да използвате прясно събрани проби за екстракция на РНК.
3. Недостатъчен лизис на пробата
Препоръка: Моля, уверете се, че пробата и работният разтвор (линеен акриламид) са били добре смесени и инкубирани за 10 минути при стайна температура (15-25 ° C)
4. Елуентът е добавен неправилно
Препоръка: Уверете се, че ddH2O без РНКаза е добавен към средата на мембраната на колоната за пречистване
5. Неподходящ обем безводен етанол в буфер viRW2
Предложение: Моля, следвайте инструкциите, добавете правилния обем безводен етанол към Buffer viRW2 и ги разбъркайте добре, преди да използвате комплекта.
6. Неправилно използване на проба.
Предложение: 200 µl проба на 500 µl буфер viRL.Прекомерният обем на пробата ще доведе до намалена скорост на екстракция на РНК.
7. Неправилен обем на елуиране или непълно елуиране.
Предложение: Обемът на елуента на колоната за пречистване е 30-50 μl;ако ефектът на елуиране не е задоволителен, се препоръчва да добавите предварително загрят ddH без РНКаза2O и удължете времето за поставяне на стайна температура, например 5-10 минути
8. Колоната за пречистване има остатък от етанол след промиване в буфер viRW2.
Предложение: Ако етанолът все още остава след изплакване в буфер viRW2 и центрофугиране в празна епруветка за 2 минути, колоната за пречистване може да се остави на стайна температура за 5 минути след центрофугиране в празна епруветка, за да се отстрани напълно останалият етанол.
Разграждането на пречистени РНК молекули
Качеството на пречистената РНК е свързано с фактори като съхранение на пробата, замърсяване с РНКаза и работа.
Анализ на често срещаните причини:
1. Събраните проби не са били запазени навреме.
Предложение: Ако пробата не се използва навреме след вземането, моля, съхранявайте я при -80 ℃ или течен азот веднага.За извличане на РНК молекули, опитайте се да използвате прясно събрани проби, когато е възможно.
2. Събраните проби се замразяват и размразяват многократно.
Предложение: Избягвайте многократно замразяване и размразяване (не повече от веднъж) по време на събиране и съхранение на пробата, в противен случай добивът на нуклеинова киселина ще намалее.
3. РНКаза е въведена в операционната зала или не са носени еднократни ръкавици, маски и др.
Предложение: Екстракцията на РНК молекулите се извършва най-добре в отделна операционна зала за РНК и експерименталната маса се почиства преди експеримента.Носете ръкавици и маски за еднократна употреба по време на експеримента, за да избегнете разграждането на РНК, причинено от въвеждането на РНКаза.
4. Реагентът е замърсен от РНКаза по време на употреба.
Предложение: Заменете с нов комплект за изолиране на вирусна РНК за свързани експерименти.
5. Замърсяването с РНКаза на центрофужните епруветки, накрайниците на пипетите и т.н. Предложение: Уверете се, че всички центрофужни епруветки, накрайниците на пипетите и пипетите не съдържат РНКаза.
Пречистените РНК молекули повлияха на експериментите надолу по веригата
Молекулите на РНК, пречистени от колоната за пречистване, ще повлияят на експериментите надолу по веригата, ако има твърде много солни йони или протеини, като например: обратна транскрипция, Northern Blot и др.
1. В елуираните РНК молекули има останали йони на солта.
Препоръка: Уверете се, че правилният обем безводен етанол е добавен към буфер viRW2 и измийте колоната за пречистване два пъти в съответствие с правилната скорост на центрофугиране в инструкциите за работа；Ако все още има останали йони на солта, можете да добавите буфер viRW2 към колоната за пречистване и да я оставите на стайна температура за 5 минути.След това извършете центрофугиране, за да отстраните в най-голяма степен замърсяването със солни йони
2. В елуираните РНК молекули има останал етанол
Предложение: след като потвърдите, че колоните за пречистване са изплакнати с буфер viRW2, извършете центрофугиране в празна епруветка в съответствие със скоростта на центрофугиране в инструкциите за работа.Ако все още има останал етанол, той може да се остави за 5 минути на стайна температура след центрофугиране в празна епруветка, за да се отстрани в най-голяма степен останалият етанол.
Ръководства за употреба:
Ръководство с инструкции за комплект за изолиране на вирусна РНК
