Добре известно е, че в централната догма РНК е транскрипционният медиатор между ДНК и протеиновата експресия.В сравнение с откриването на ДНК, откриването на РНК може по-обективно да отразява генната експресия в организмите.Експериментите, включващи РНК, включват: qRT-PCR, RNA-Seq и откриване на слят ген и т.н. Въз основа на характеристиките на самата РНК (захарният пръстен на РНК има още една свободна хидроксилна група от захарния пръстен на ДНК), заедно с голям брой РНКази в околната среда, РНК е по-нестабилна и по-лесна за разграждане от ДНК.Боклук навътре, боклук навън, ако качеството на РНК не е добро, тогава експерименталните резултати трябва да са незадоволителни, конкретно проявени като неточни данни или лоша повторяемост.Следователно трябва да се обърне повече внимание на обработката на РНК и връзката на контрола на качеството също е по-важна, за да се гарантира прецизността и точността на последващите експериментални данни.

За контрол на качеството на РНК обикновено има следните често използвани методи:

• Спектрофотометрия
• електрофореза в агарозен гел
• Биоанализатор Agilent
• флуоресцентна количествена PCR в реално време
• Метод на флуоресцентно багрило Qubit

01 Спектрофотометрия

РНК има конюгирани двойни връзки и има пик на абсорбция при дължина на вълната 260 nm.Съгласно закона на Lambert-Beer, можем да изчислим концентрацията на РНК от пика на абсорбция при 260 nm.Освен това можем също да изчислим чистотата на РНК според съотношението на 260nm, 280nm и 230nm пикове на абсорбция.280nm и 230nm са съответно пиковете на абсорбция на протеини и малки молекули.Съотношението на A260/A280 и A260/A230 на квалифицирана чистота на РНК трябва да бъде по-голямо от 2. Ако е по-малко от 2, това означава, че има замърсяване с протеин или малка молекула в пробата на РНК и трябва да се пречисти отново.Източниците на замърсяване ще повлияят на експериментите надолу по веригата, като например инхибиране на ефективността на усилване на PCR реакциите, което ще доведе до неточни количествени резултати.Чистотата на РНК има голямо влияние върху последващите резултати, така че спектрофотометрията обикновено е незаменима връзка за контрол на качеството в първата стъпка в експериментите с нуклеинова киселина.

Фигура 1. Типичен РНК/ДНК абсорбционен спектър

02 Електрофореза в агарозен гел

В допълнение към чистотата, целостта на РНК също е един от важните показатели за преценка на качеството на РНК.Разграждането на РНК ще доведе до голям брой къси фрагменти в пробата, така че броят на РНК фрагментите, които могат да бъдат ефективно открити и покрити от референтната последователност, ще бъде намален.Целостта на РНК може да се провери чрез електрофореза на обща РНК върху 1% агарозен гел.Този метод може да конфигурирате гела сами или да използвате сглобяемата система E-Gel™ за тестване на целостта.Повече от 80% от общата РНК е рибозомна РНК, по-голямата част от която е съставена от 28S и 18S рРНК (в системите на бозайниците).РНК с добро качество ще покаже две очевидни ярки ленти, които са 28S и 18S ярки ленти, съответно, при 5 Kb и 2 Kb, и съотношението ще бъде близо до 2:1.Ако е в дифузно състояние, това означава, че РНК пробата може да е била разградена и се препоръчва да се използва методът, описан по-късно, за по-нататъшно тестване на качеството на РНК.

Фигура 2. Сравнение на разградена (лента 2) и непокътната РНК (лента 3) при електрофореза в агарозен гел

03 Биоанализатор Agilent

В допълнение към метода за електрофореза в агарозен гел, описан по-горе, който може да ни помогне да идентифицираме целостта на РНК лесно и бързо, можем също да използваме биоанализатора Agilent, за да определим целостта на РНК.Той използва комбинация от микрофлуиди, капилярна електрофореза и флуоресценция за оценка на концентрацията и целостта на РНК.Чрез използването на вградения алгоритъм за анализиране на профила на РНК пробата, биоанализаторът на Agilent може да изчисли референтна стойност на интегритета на РНК, RNA Integrity Number (наричан по-долу RIN) [1].Колкото по-голяма е стойността на RIN, толкова по-висока е целостта на РНК (1 е изключително разградена, 10 е най-пълната).Някои експерименти, включващи РНК, предполагат използването на RIN като параметър за оценка на качеството.Вземайки високопроизводителни секвениращи експерименти (наричани по-нататък NGS) като пример, насоките на Oncomine™ Human Immune Repertoire, който се използва за откриване на В-клетъчни и Т-клетъчни антигенни рецептори в панелната серия Oncomine на Thermo Fisher, предполагат, че проби с RIN стойности, по-големи от 4, могат да бъдат измерени по-ефективни отчитания и клонинги (Фигура 3).Има различни препоръчителни диапазони за различните панели и често по-висок RIN може да донесе по-ефективни данни.

Фигура 3, в експерименти с Oncomine™ човешки имунен репертоар, проби с RIN по-голям от 4 могат да открият по-ефективни показания и Т клетъчни клонове.【2】

Стойността на RIN обаче също има някои ограничения.Въпреки че RIN има висока корелация с качеството на експерименталните данни от NGS, той не е подходящ за проби от FFPE.Пробите от FFPE са били химически третирани дълго време и извлечената РНК обикновено има относително ниска стойност на RIN.Това обаче не означава, че ефективните данни от експеримента трябва да са незадоволителни.За да оценим точно качеството на пробите FFPE, трябва да използваме измервания, различни от RIN.В допълнение към RIN, биоанализаторът на Agilent може също да изчисли стойността на DV200 като параметър за оценка на качеството на РНК.DV200 е параметър, който изчислява дела на фрагменти, по-големи от 200 bp в РНК проба.DV200 е по-добър показател за качеството на пробата FFPE от RIN.За РНК, извлечена от FFPE, тя има много висока корелация с броя на гените, които могат да бъдат ефективно открити, и разнообразието от гени [3].Въпреки че DV200 може да компенсира недостатъците в откриването на качеството на FFPE, биоанализаторът на Agilent все още не може да анализира изчерпателно проблемите с качеството в РНК пробите, включително дали има инхибитори в пробите.Самите инхибитори могат да повлияят на ефективността на усилване на експериментите надолу по веригата и да намалят количеството полезни данни.За да знаем дали има инхибитор в пробата, можем да приемем флуоресцентния количествен PCR метод в реално време, описан по-долу.

04 флуоресцентна количествена PCR в реално време

Флуоресцентният количествен PCR метод в реално време може не само да открие инхибиторите в пробата, но и да отразява точно качеството на РНК в пробата FFPE.В сравнение с биологичните анализатори на Agilent, количествените инструменти за флуоресценция в реално време са по-популярни в големите биологични лаборатории поради по-широкото им приложение.За да тестваме качеството на РНК пробите, трябва само да закупим или подготвим праймерни сонди за вътрешни референтни гени, като GUSB (Кат. № Hs00939627).Чрез използването на този набор от праймери, сонди и стандарти (обща РНК с известна концентрация) за провеждане на абсолютни количествени експерименти, ефективната концентрация на РНК фрагмент може да бъде изчислена като стандарт за оценка на качеството на РНК (функционално количествено определяне на РНК (FRQ) за кратко).В NGS тест открихме, че FRQ на РНК проби има много висока корелация с ефективния обем данни.За всички проби, по-големи от 0,2 ng/uL FRQ, поне 70% от показанията могат ефективно да покрият референтната последователност (Фигура 4).

Фигура 4, стойността на FRQ, открита чрез количествения метод на флуоресценцията, има много висока корелация (R2>0,9) с ефективните данни, получени в експеримента NGS.Червената линия е стойността на FRQ, равна на 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Освен че е приложим за FFPE проби, количественият PCR метод в реално време може също ефективно да наблюдава инхибиторите в пробите.Можем да добавим пробата за откриване в реакционната система с вътрешна положителна контрола (IPC) и нейния анализ и след това да извършим количествено определяне на флуоресценцията, за да получим стойността на Ct.Ако стойността на Ct изостава от стойността на Ct в реакцията без проба, това показва, че инхибиторът присъства в пробата и инхибира ефективността на усилване в реакцията.

05 Метод на флуоресцентно багрило Qubit

Qubit Fluorometer е най-често използваното малко устройство за откриване на концентрация и чистота на нуклеинова киселина, което е лесно за работа и съществува в почти всяка лаборатория по молекулярна биология.Той изчислява точно концентрацията на нуклеинова киселина чрез откриване и свързване на нуклеинова киселина флуоресцентно багрило (реагент за откриване Qubit).Qubit има висока чувствителност и специфичност и може точно да определи количествено РНК до концентрация на pg/µL.В допълнение към добре известната способност за точно количествено определяне на концентрацията на нуклеинова киселина, последният нов модел на Thermo Fisher, Qubit 4.0, може също да открие целостта на РНК.Системата за откриване на РНК на Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) открива целостта на РНК чрез едновременно откриване на две специфични флуоресцентни багрила.Тези две флуоресцентни багрила могат да се свързват съответно с големи фрагменти и малки фрагменти от РНК.Тези две флуоресцентни багрила показват съотношението на големи фрагменти от РНК в пробата и от това може да се изчисли стойността на IQ (цялост и качество), представляваща качеството на РНК.Стойността на IQ е приложима както за FFPE, така и за проби без FFPE и има голямо влияние върху качеството на последващото секвениране.Като вземем за пример експериментите с NGS, в тестовите експерименти с RNA-Seq, извършени на платформата Ion torrent™, повечето проби със стойности на IQ над 4 имат най-малко 50% ефективни показания (Фигура 5).В сравнение с гореспоменатите методи за откриване, Qubit IQ Assay е не само по-удобен за работа и отнема по-малко време (в рамките на пет минути), но също така има голяма корелация между измерената стойност на параметъра IQ и качеството на данните от експериментите надолу по веригата.

Фигура 5, има голяма корелация между стойността на Qubit RNA IQ и картографираните показания на RNA-Seq.【5】

Чрез горното въведение вярвам, че всеки има достатъчно разбиране за различните методи за контрол на качеството на РНК.На практика можете да избиратесъответния метод според типа на пробата и съществуващите инструменти.Само чрез добър контрол на качеството на РНК можем да избегнем провала на последващи експерименти, причинени от лошо качество на пробата, като по този начин спестяваме ценно време, енергия и разходи.

Референтни продукти:

Комплект за изолиране на тотална РНК от животни

Комплект за изолиране на обща РНК клетка

препратки

【1】Шрьодер, А., Мюлер, О., Стокър, С. и др.RIN: номер за интегритет на РНК за присвояване на стойности за интегритет на РНК измервания.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Ръководство за потребителя на Oncomine Human Immune Repertoire (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, том 170, брой 2, август 2019 г., страници 357 –373,https://doi.org/10.1093/toxsci/