Ние сме опитен производител.Спечелване на мнозинството в решаващите сертификати на своя пазар за Голяма отстъпка Китай Високочувствителна едностъпкова сонда Rt-QpcrКомплект V2, Качеството е фабричен живот, Фокусът върху търсенето на клиента е източникът на оцеляване и развитие на компанията, Ние се придържаме към честността и добросъвестното работно отношение, очакваме с нетърпение вашето идване!
Ние сме опитен производител.Спечелване на мнозинството в решаващите сертификати на своя пазар заChina Taq ДНК полимераза, Qpcr, Нашата компания обещава: разумни цени, кратко време за производство и задоволително следпродажбено обслужване, ние също ви приветстваме да посетите нашата фабрика по всяко време, което пожелаете.Желая сега да имаме приятен и дългосрочен бизнес заедно!!!

Описания

Този комплект използва уникална буферна система за лизис, която може бързо да освободи РНК от култивирани клетъчни проби за RT-qPCR реакции, като по този начин елиминира отнемащия време и трудоемък процес на пречистване на РНК.Шаблонът на РНК може да бъде получен само за 7 минути.Реагентите 5×Direct RT Mix и 2×Direct qPCR Mix-SYBR, предоставени от комплекта, могат бързо и ефективно да получат количествени резултати от PCR в реално време.

5×Direct RT Mix и 2×Direct qPCR Mix-SYBR имат силна толерантност към инхибитори и лизатът от пробите може да се използва като шаблон за RT-qPCR директно.Този комплект съдържа уникалната RNA обратна транскриптаза Foregene с висок афинитет и Hot D-Taq ДНК полимераза, dNTPs, MgCl₂, реакционен буфер, PCR оптимизатор и стабилизатор.

Спецификации

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Компоненти на комплекта

Характеристики и предимства

■ Просто и ефективно: с технологията Cell Direct RT, РНК проби могат да бъдат получени само за 7 минути.

■ Търсенето на проби е малко, могат да бъдат тествани само 10 клетки.

■ Висока производителност: може бързо да открие РНК в клетки, култивирани в 384, 96, 24, 12, 6-ямкови плаки.

■ DNA Eraser може бързо да премахне освободените геноми, значително да намали въздействието върху последващите експериментални резултати.

■ Оптимизираната RT и qPCR система прави двуетапната RT-PCR обратна транскрипция по-ефективна и PCR по-специфична и по-устойчива на инхибитори на RT-qPCR реакцията.

Приложение на комплекта

Обхват на приложение: култивирани клетки.

- РНК, освободена чрез лизис на пробата: приложимо само за RT-qPCR шаблона на този комплект.

- Комплектът може да се използва за следните цели: анализ на генната експресия, проверка на ефекта на заглушаване на гена, медииран от siRNA, скрининг на лекарства и др.

Диаграма

Съхранение и срок на годност

Част I от този комплект трябва да се съхранява при 4 ℃;Част II трябва да се съхранява при -20 ℃.

Foregene Protease Plus II трябва да се съхранява при 4 ℃, не замразявайте при -20 ℃.

Реагент 2×Direct qPCR Mix-SYBR трябва да се съхранява при -20 ℃ на тъмно;ако се използва често, може също да се съхранява при 4 ℃ за краткосрочно съхранение (използвайте в рамките на 10 дни). Ние сме опитен производител.Спечелване на мнозинството в решаващите сертификати на своя пазар за Големи отстъпки Китай Високочувствителна едностъпкова сонда Rt-Qpcr Kit V2, Качеството е животът на фабриката, Фокусът върху търсенето на клиентите е източникът на оцеляване и развитие на компанията, Ние се придържаме към честността и добросъвестното работно отношение, очакваме с нетърпение вашето идване!
Голяма отстъпкаChina Taq ДНК полимераза, Qpcr, Нашата компания обещава: разумни цени, кратко време за производство и задоволително следпродажбено обслужване, ние също ви приветстваме да посетите нашата фабрика по всяко време, което пожелаете.Желая сега да имаме приятен и дългосрочен бизнес заедно!!!

QuickEасиTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Кат.No.DRT-01021/01022

За клетъчна директна RT-qPCR с използване на ≤ 1000 000 клетки

Представяне на продукт

Този продукт използва уникална буферна система за лизис за бързо освобождаване на РНК от култивирани клетъчни проби за RT-qPCR реакции, като елиминира отнемащия време и трудоемък процес на пречистване на РНК и само 7 минути за получаване на необходимия РНК шаблон, с 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman, осигурен от комплекта, може бързо и ефикасно да получи количествени PCR резултати в реално време.

5× Direct RT Mix и 2× Direct qPCR Mix-Taqman имат силна инхибиторна толерантност и могат да извършат ефикасно обръщане и специфично усилване, като използват лизата на пробата, която ще се измерва като шаблон.Реагентът съдържа Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq ДНК полимераза, dNTPs, MgCl₂, реакционен буфер, PCR оптимизатор и стабилизатор, който може да се използва с лизисен буфер за бързо и лесно откриване на проби и има характеристиките на висока чувствителност, специфичност и стабилност.

Характеристики на продукта

Проста, ефективна технология Cell Direct RT, която отнема само 7 минути за получаване на РНК проби.

Изискванията за проби са малки и минимум 10 култивирани клетки могат да се използват за експериментиране.

Висока производителност за бързо получаване на РНК от култивирани клетки като 384, 96, 24, 12 и 6-ямкови плаки.

DNA Eraser е в състояние бързо да премахне освободените геноми, като значително намалява въздействието върху последващите експериментални резултати.

Оптимизираните RT и qPCR системи позволяват двуетапна RT-PCR с по-ефективна обратна транскрипция, специфичност и по-силна толерантност към инхибитора на RT-qPCR реакцията.

Приложение на комплекта

Обхват на приложение: Култивирани клетки.

РНК, интерпретирана с лизис на проба: използва се само като двуетапен RT-qPCR шаблон.

Комплектите могат да се използват за следните цели: анализ на генната регулаторна експресия, тестване на алели, скрининг на лекарства и др.

Ограничения на комплекта

Амплифицирани фрагменти ≤ 300 bp.

Комплектите се използват за прясно култивиране на клетки.

Контрол на качеството на продукта

Съгласно системата за цялостно управление на качеството на FOREGENE, всяка партида комплекти от серия Cell Direct RT-qPCR се тества стриктно многократно, за да се гарантира надеждността и стабилността на качеството на всяка партида комплекти.

Съдържание на комплекта

*:Клетъчен лизис, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman могат да бъдат закупени отделно, подробностите са дадени в Приложение 1 (СТРАНИЦА 13).

Условия за съхранение

1. Условия за доставка

Целият процес на транспортиране на кутия с лед при ниска температура, за да се гарантира, че комплектът е в състояние <4 °C.

2. Условия на съхранение

Съхранявайте част I при 4°C и част II при -20°C.

Foregene Protease Plus II трябва да се съхранява при 4°C, да не се замразява при -20°C.

Реагент 2× Direct qPCR Mix-Taqman се съхранява при -20°C или при 4°C за краткотрайна употреба, ако се използва често (в рамките на 10 дни).

Информация за компонентите на комплекта

Буфер CL: Осигурява средата, необходима за реакциите на клетъчен лизис.

Буфер ST: Прекратява активното вещество в лизата, за да се избегнат ефекти върху последващата RT.

DNA Eraser: средство за премахване на ДНК, ефектът от премахването на генома върху последващи експерименти.

5× Direct RT Mix: Съдържа Foregene обратна транскриптаза с висок РНК афинитет, инхибитор на RNase, dNTP, стабилизатори, подобрители, оптимизатори и праймери за обратна транскрипция за оптимално подравняване (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Грунд).

Foregene Protease Plus II: В контекста на лизисния буфер клетките се лизират, за да освободят нуклеинови киселини.

2× Директен qPCR Mix-Taqman: Този реагент съдържа гореща D-Taq ДНК полимераза, dNTPs, MgCl₂, реакционен буфер, PCR оптимизатор и стабилизатор.

20× ROX Reference Dye: Обикновено се използва в инструментите за PCR амплификация в реално време на ABI, Stratagene и други компании, използва се за коригиране на разликата между PCR епруветките и епруветките, причинени от PCR грешки при дозиране.Концентрацията на 20 × ROX Reference Dye, необходима за различните инструменти, е различна и потребителят може да я добави според препоръчителната концентрация на инструмента.

ddH без РНКаза₂O: стерилизирана свръхчиста вода без РНКаза за двуетапни RT-qPCR реакции.

Предпазни мерки:(Не забравяйте да прочетете внимателно предпазните мерки, преди да използвате комплекта)

Обърнете внимание на метода на работа на експеримента, за да избегнете кръстосано замърсяване между пробите.

Обърнете внимание на чистотата на експерименталната среда и приборите, за да избегнете замърсяване с РНКаза и разграждане на РНК.

Вземете пресни или добре запазени клетъчни проби и никога не използвайте повторно замразени-размразени клетъчни проби.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman трябва да избягва повторно замразяване-размразяване, в противен случай това ще повлияе на обратната транскрипция и ефективността на PCR.

Подготовкадажбипредиоперация

Не забравяйте да прочетете внимателно инструкциите, преди да използвате този комплект.Комплектът Cell Direct RT-qPCR е прост, удобен и бърз за работа, а инструкциите предоставят пълна информация за целия комплект и как да го използвате правилно.Моля, подгответе необходимите експериментални материали и оборудване преди употреба.

Експериментални материали и оборудване

◆ Културални клетки.

◆ 1,5 ml или 2 ml, центрофужна епруветка без RNase-/DNase, накрайник без RNase-/DNase, 0,2 ml стерилна qPCR епруветка.

◆ qPCR машина, пипета, настолна центрофуга (≥13 400×g) (в зависимост от експерименталните нужди) и др.

Безопасност

◆ Този продукт е само за научноизследователски цели, моля, не го използвайте за фармацевтични, клинични, хранителни и козметични цели.

◆ Когато използвате химикали, носете подходящи лабораторни дрехи, ръкавици, защитни очила и др.

Операцияводачи

Системи за клетъчен лизис, RT системи и qPCR реакционни разтвори за добавки могат да бъдат закупени отделно, за подробности в Приложение 1 (СТРАНИЦА 13).

Ръководство за работа

A: Проба освобождаване на РНК

1. Клетките са предварително обработени: Измийте плочата с клетъчна култура със студен PBS, след това лизирайте клетките (10-10⁶), 10⁶ отколкото количеството клетки, се препоръчва Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) или Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) за екстракция и пречистване на РНК.

1.1.Прилепнали клетки (24-ямкова плака като пример)

1.1.1.Определете броя на клетките във всяка ямка, определете, че броят на клетките е 1 × 10⁵и използвайте пипета, за да отстраните културалната среда от съда с културата.

1.1.2.Добавете 200 μl предварително охладен 1 × PBS към всяка ямка.Не пипетирайте многократно и отстранете PBS от ямките.Наклонете плочата и отстранете колкото е възможно повече PBS.Продължете към стъпка 2.

1.1.3.Различно блюдо за клетъчна култура или таблица с референтен номер 1-1 в блюдо за клетъчна култура се добавя предварително охладен 1 × PBS за промиване на клетките.

Таблица 1-1: Дозировка на PBS за различен брой клетки

Забележка:За осигуряване на здраво прилепнали клетки，загубата на голям брой клетки се избягва при измиване.

1.2.Суспензионни клетки или прилепнали клетки, култивирани в непорести плаки

1.2.1.Прилепнали клетки, култивирани в не многоямкови плаки (суспензионните клетки започват от следващата стъпка 1.2.2), събират се и се разделят клетките съгласно нормалния метод за събиране на клетки и се поставят в културална плака или центрофужна епруветка;ако се използва трипсинизация, изисква се центрофугиране за събиране на клетките и за отстраняване на остатъчния трипсин, добавени PBS ресуспендирани клетки в отделни клетки за диспергиране на клетките.

1.2.2.След броя на преброените клетки, аликвотирани клетки 1 × 10⁵ една за центрофугиране на епруветки, събиране на клетки чрез центрофугиране при 1000 × g за 10 минути.

1.2.3.Добавете 200 μl PBS към центрофужната епруветка, не пипетирайте многократно и директно аспирирайте PBS.преминете към стъпка 2. (Ако е трудно да се утаи и клетките са ресуспендирани отново, може да се извърши 1000×g центрофугиране 10 минути след изхвърляне на супернатанта, клетъчната пелета преминете към стъпка 2)

2. Клетъчен лизис: Отстранете буфера CL, температурата му е уравновесена със стайна температура, DNA Eraser и Foregene Protease Plus II, съгласно следната таблица 1-2, подготвена система за лизиране: (разтворът за лизис е готов за употреба).

Таблица 1-2: разцепване подготовка на системата (Забележка: при подготовка на лед)

3. (Плака с 24 ямки като пример) Пипетирайте 200 μl от основната смес за клетъчен лизис във всяка ямка, Многократно продухвайте 5-10 пъти, Инкубирайте при стайна температура (20-25 ℃) за 5 минути.

Забележка:За да избегнете образуването на мехурчета, моля, когато пипетирате, скалата на пипетата е коригирана на 200 μl или по-малко.Клетките може да изглеждат мътни след лизис, което е нормално.

4. (Плака с 24 ямки като пример) се добавят към течността 20 μl буфер ST (различни системи за лизис, буфер ST се добавя в количество, показано в таблица 1-3), повтаря се пипетиране 5-10 пъти, при стайна температура (20-25 ℃) се инкубират за 2 минути.

Забележка:Върхът на пипетата, разположен под повърхността, гарантира, че лизатът е добавен，за да избегнете образуването на мехурчета, моля, когато пипетирате, скалата на пипетата е коригирана на 200 μl или по-малко.

Таблица 1-3:Добавяне на буфер ST

5. Лизатът се използва за последващи RT-qPCR експерименти.Ако следващите експерименти не могат да бъдат извършени навреме, моля, дръжте го върху лед за не повече от 2 часа и съхранявайте при -20 ℃ или -80 ℃ (не повече от три месеца).

B: Подготовка на RT системата

1. Извадете 5 × Direct RT Mix и го поставете на ледена баня, оставете го да се разтопи естествено и внимателно го разбъркайте за по-късна употреба;извадете ddH2O без РНКаза и го разтопете и го поставете на ледена баня за по-късна употреба.Подгответе реакционната система върху лед съгласно таблица 2-1 по-долу.

Таблица 2-1: Приготвяне на RT реакционна система

2. След завършване на формулирането на системата внимателно се разбърква и центрофугира за кратко в следната таблица 2 -2 реакционни условия RT реакция.

Таблица 2-2: Настройка на условието за RT реакция

3. След завършване на реакцията реакционният продукт беше поставен директно върху лед за qPCR, моля, поставете дългосрочно съхранение на -20 ℃ или -80 ℃.

Забележка: Поради използването на непречистен шаблон, в продукта на обратната транскрипция може да се появят бели утайки.Това е нормално явление.Центрофугирайте незабавно супернатантата за следващите експерименти.

Полученият RT реакционен разтвор се добавя към следващата стъпка PCR реакционни системи в реално време, препоръчва се да се добавят количества, вариращи от 10-30% от реакционната система.

C: Подготовка на qPCR реакционна система

1. Подходящо количество В, приготвено в етапна cDNA матрица съгласно следващата таблица 3-1, за да се подготви реакционна система.

Забележка: Количеството cDNA шаблон представлява 10-30% от qPCR системата.Например, в 20 μl qPCR система добавете 2-6 μl лизисен буфер, но не повече от 6 μl.

2. Добрите условия за оптимизиране на qPCR (температура на отгряване и т.н.) за qPCR реакция (Реакционните условия, дадени в Таблица 3-2).

Забележка: Опитайте се да използвате оптимизирани условия за qPCR реакции, за да получите по-добри резултати.

Таблица 3-1: Приготвяне на PCR реакционна система

1*: Концентрацията на праймера може да се регулира в диапазона от 50-900 nM, когато реакцията на праймера е лоша.

Забележка: Системата qPCR може да се регулира според експерименталните нужди и модела на флуоресцентния цикъл.За qPCR в 50μl система, регулирайте дозата на реагента пропорционално според 20μl система.

2*: Изберете подходящата крайна концентрация на ROX Reference Dye според флуоресцентния количествен термичен цикъл.Най-подходящите концентрации на ROX Reference Dye за обичайните флуоресцентни количествени цикли са показани в таблицата по-долу:

Таблица 3-2: Предоставени са условия на qPCR реакция

Забележка: За да се получи най-добър qPCR ефект, може да се използва градиентна PCR за оптимизиране на реакционните условия за различни шаблони и различни праймери.Условията на реакцията на PCR варират в зависимост от флуоресцентния анализатор, шаблона, праймера и т.н. При конкретната операция оптималните реакционни условия трябва да бъдат проектирани в съответствие със специфичните условия на флуоресцентния количествен термичен цикъл, типа на шаблона, размера на интересния фрагмент, базовата последователност на амплифицирания фрагмент и съдържанието на GC и дължината на праймерите, включително температура на отгряване, време на реакция и др.

Принципи на проектиране на праймер за PCR в реално време

Преден грунд и обратен грунд

За PCR в реално време дизайнът на праймера е много важен.Праймерите са свързани със спецификата и ефективността на PCR амплификацията и могат да бъдат проектирани с позоваване на следните принципи:

◆ Дължина на праймера: 18-30 bp.

◆ GC съдържание: 40-60%.

◆ Стойност на Tm: Софтуерът за проектиране на праймер, като Primer 5, може да даде стойността на Tm на праймера.Стойностите на Tm на праймерите нагоре и надолу по веригата трябва да бъдат възможно най-близки.Може да се използва и формулата за изчисление на Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Когато се извършва PCR, температура под стойността на Tm на праймера от 5 °C обикновено се избира като температура на отгряване (съответното повишаване на температурата на отгряване може да увеличи специфичността на PCR реакцията).

◆ Праймери и PCR продукти:

◆ Дължината на продукта за PCR амплификация на праймера за дизайн е за предпочитане 100-150 bp.

◆ Грундовете за проектиране във вторичната структурна област на шаблона трябва да се избягват, доколкото е възможно.

◆ Избягвайте образуването на 2 или повече комплементарни бази между 3' краищата на праймерите нагоре и надолу по веригата.

◆ Основата на праймера 3′ не може да присъства с 3 допълнителни последователни G или C.

◆ Самите праймери не могат да имат комплементарни структури, в противен случай ще се образува структура на фиби, което засяга PCR амплификацията.

◆ ATCG трябва да бъде разпределен възможно най-равномерно в последователността на праймера и 3' терминалната база трябва да се избягва, тъй като T.

Приложение1:Cell DirectRT-qPCR Комплект компонентиt добавка пакет

1. Разтвор за клетъчен лизис