Стерилизация на накрайници за пипети и ЕР тръби и др.

1. Пригответе 0,1% (една хилядна) DEPC (силно токсично вещество) с дейонизирана вода, използвайте го внимателно в абсорбатор и го съхранявайте при 4°C далеч от светлина;

DEPC водата е чиста вода, обработена с DEPC и стерилизирана при висока температура и високо налягане.Тестван е без РНКаза, ДНКаза и протеиназа.

2. Поставете върха на пипетата и EP тръбата в 0,1% DEPC и се уверете, че върхът на пипетата и EP тръбата са напълнени с 0,1% DEP.

3. Пазете от светлина, оставете да престои една нощ (12-24 часа)

4. Кутията, съдържаща накрайника и EP тръбата, не е необходимо да се накисва в DEPC.След като грубо отстраните DEPC водата в накрайника или EP тръбата, опаковайте я и я увийте.

5. 121 градуса по Целзий, 30мин

6. 180 градуса по Целзий, изсушете няколко часа (поне 3 часа)

Забележка: а.Носете латексови ръкавици и маски при работа с DEPC!b, или без DEPC стерилизация, 130 ℃, 90 минути автоклав (много лаборатории стерилизират при висока температура два пъти)

Съображения за екстракция на РНК

Два основни феномена на неуспешно изолиране на тъканна РНК

Разграждане на РНК и остатъци от примеси в тъканите,относно разграждането, нека първо да разгледаме защо РНК, извлечена от култивирани клетки, не се разгражда лесно.Всички съществуващи реагенти за екстракция на РНК съдържат компоненти, които бързо инхибират РНКазата.Добавете лизата към култивираните клетки и просто го разбъркайте, всички клетки могат да бъдат напълно смесени с лизата и клетките са напълно лизирани.След като клетките се лизират, активните съставки в лизата незабавно инхибират вътреклетъчната РНКаза, така че РНК остава непокътната.С други думи, тъй като култивираните клетки са лесно и напълно в контакт с лизата, тяхната РНК не се разгражда лесно;от друга страна, РНК в тъканта лесно се разгражда, тъй като клетките в тъканта не се свързват бързо с лизата.поради достатъчен контакт.Така,ако приемем, че има начин да превърнем тъканта в една клетка, като същевременно инхибираме активността на РНК, проблемът с разграждането може да бъде напълно решен.

Смилането с течен азот е най-ефективният такъв метод.Въпреки това, методът на смилане с течен азот е много обезпокоителен, особено когато броят на пробите е голям.Това доведе до следващото най-добро нещо: хомогенизатора.Theхомогенизаторметодът не разглежда въпроса как се инхибира активността на RNase преди клетките да са в контакт с лизата, а по-скоро се моли скоростта на разрушаване на тъканите да е по-бърза от скоростта, с която вътреклетъчната RNase разгражда RN.

Ефектът на електрическия хомогенизатор е по-добър,и ефектът от стъкления хомогенизатор е слаб, но като цяло методът на хомогенизатора не може да предотврати явлението на разграждане.Следователно, ако екстракцията се влоши, оригиналният електрически хомогенизатор трябва да се използва за смилане с течен азот;оригиналният стъклен хомогенизатор трябва да се смени с електрически хомогенизатор или директно да се смила с течен азот.Проблемът е почти 100% осъществим.решете се.

Проблемът с остатъците от примеси, засягащ последващите експерименти, има по-разнообразни причини от разграждането и съответно решенията са различни.В заключение,ако има разграждане или остатъчни примеси в тъканта, методът/реагентът за екстракция за конкретния експериментален материал трябва да се оптимизира.Не е нужно да използвате ценните си проби за оптимизация: можете да купите някои малки животни като риба/пиле от пазара, да вземете съответната част от материала за екстракция на РНК, а другата част за екстракция на протеини – смилайте с екстракт от устата, стомаха и червата.

Целевата РНК на извлечената РНК се използва за различни последващи експерименти и нейните изисквания за качество са различни

конструкцията на cDNA библиотека изисква цялост на RNA без остатъци от инхибитори на ензимна реакция;Northern изисква по-висока цялост на РНК и по-ниски изисквания за остатъци от инхибитори на ензимни реакции;RT-PCR не изисква твърде висока цялост на РНК,но инхибира ензимните реакции.Изискванията за остатъци са строги.Входът определя изхода;всеки път, когато целта е да се получи РНК с най-висока чистота, това ще струва на хората и пари.

Събиране/съхранение на проби

Фактори, влияещи върху разграждането След като пробата напусне живото тяло/или първоначалната среда на растеж, ендогенните ензими в пробата ще започнат да разграждат РНК,и скоростта на разграждане е свързана със съдържанието на ендогенни ензими и температура.Традиционно има само два начина за пълно инхибиране на ендогенната ензимна активност: незабавно добавяне на лизат и хомогенизиране старателно и бързо;нарежете на малки парчета и веднага замразете в течен азот.И двата подхода изискват бърза работа.Последният е подходящ за всички проби, докато първият е подходящ само за тъкани с ниско съдържание на клетки и ендогенни ензими и по-лесни за хомогенизиране.По-конкретно, растителна тъкан, черен дроб, тимус, панкреас, далак, мозък, мазнини, мускулна тъкан и т.н. е най-добре да се замразят с течен азот, преди да се продължи.

Фрагментиране и хомогенизиране на проби

Фактори, влияещи върху разграждането и добива Фрагментацията на пробата еза пълно хомогенизиране, което е за пълно и пълно освобождаване на РНК.Клетките могат да бъдат директно хомогенизирани, без да бъдат разбити.Тъканите могат да се хомогенизират само след начупване.Дрождите и бактериите трябва да бъдат разбити със съответните ензими, преди да могат да бъдат хомогенизирани.Тъканите с по-ниско съдържание на ендогенни ензими и по-лесно хомогенизиране могат да бъдат смачкани и хомогенизирани наведнъж в лизата чрез хомогенизатор;растителна тъкан, черен дроб, тимус, панкреас, далак, мозък, мазнини, мускулна тъкан и други проби, Те са или с високо съдържание на ендогенни ензими, или не се хомогенизират лесно,така че разрушаването на тъканите и хомогенизирането трябва да се извършват отделно.Най-надеждният и най-производителен метод за раздробяване е смилането с течен азот, а най-надеждният метод за хомогенизиране е използването на електрически хомогенизатор.Специална забележка относно смилането с течен азот: пробата не трябва да се размразява по време на целия процес на смилане, тъй като е по-вероятно ендогенните ензими да функционират, когато са замразени.

Избор на лизат

Влияние върху удобството на работа и факторите на остатъчни ендогенни примеси Често използваните лизиращи разтвори могат почти да инхибират активността на РНКазата.Следователно ключовият момент при избора на лизиращ разтвор е да се вземе предвид в комбинация с метода на пречистване.Има едно изключение:проби с високо съдържание на ендогенни ензими се препоръчва използването на лизат, съдържащ фенол, за да се увеличи способността за инактивиране на ендогенни ензими.

Избор на метод за пречистване

Фактори, които влияят върху остатъчните ендогенни примеси, скорост на екстракция За чисти проби, като например клетки, могат да се получат задоволителни резултати с почти всеки метод за пречистване.Но за много други проби, особено тези с високи нива на примеси като растения, черен дроб, бактерии и т.н., изборът на подходящ метод за пречистване е от решаващо значение.Методът за колонно центробежно пречистване има бърза скорост на екстракция и може ефективно да премахне примесите, които влияят на последващата ензимна реакция на РНК, но е скъп (Foregene може да предложи рентабилни комплекти, повече подробности щракнете върхутук);използването на икономични и класически методи за пречистване, като утаяване с LiCl, също може да получи задоволителни резултати, но времето за работа е дълго..

„Три дисциплини и осем внимание“ за извличане на РНК

Дисциплина 1:Сложете край на замърсяването с екзогенни ензими.

Бележка 1:Носете стриктно маски и ръкавици.

Бележка 2:Центрофужните епруветки, главите на накрайниците, прътите за пипети, резервоарите за електрофореза и експерименталните стендове, включени в експеримента, трябва да се изхвърлят щателно.

Бележка 3:Реагентите/разтворите, включени в експеримента, особено водата, трябва да не съдържат РНКаза.

Дисциплина 2:Блокирайте активността на ендогенните ензими

Бележка 4:Изберете подходящ метод за хомогенизиране.

Бележка 5:Изберете подходящ лизат.

Бележка 6:Контролирайте началното количество на пробата.

Дисциплина 3:Изяснете вашата цел за извличане

Бележка 7:При всяка лизатна система, която се доближава до максималното начално количество проба, степента на успешна екстракция спада рязко.

Бележка 8:Единственият икономически критерий за успешно извличане на РНК е успехът в следващите експерименти, а не добивът.

Топ 10 източника на замърсяване с РНКаза

1. Пръстите са първият източник на екзогенни ензими, така че ръкавиците трябва да се носят и сменят често.Освен това трябва да се носят и маски, защото дишането също е важен източник на ензими.Допълнителна полза от носенето на маска с ръкавици е защитата на експериментатора.

2. Накрайници на пипети, центрофужни епруветки, пипети – РНКазата не може да бъде инактивирана само чрез стерилизация, така че накрайниците на пипетите и центрофужните епруветки трябва да бъдат третирани с DEPC, дори ако са маркирани като третирани с DEPC.Най-добре е да използвате специална пипета, избършете я с памучен тампон със 75% алкохол преди употреба, особено пръчката;освен това не използвайте средство за отстраняване на глави.

3. Водата/буферът не трябва да съдържа замърсяване с РНКаза.

4. Най-малко тестовата маса трябва да се избърше с памучни топки със 75% алкохол.

5. Ендогенна РНКаза Всички тъкани съдържат ендогенни ензими, така че бързото замразяване на тъкани с течен азот е най-добрият начин за намаляване на разграждането.Методът за съхранение/смилане с течен азот е наистина неудобен, но е единственият начин за тъкани с високи нива на ендогенни ензими.

6. РНК проби Продуктите за екстракция на РНК може да съдържат следи от замърсяване с РНКаза.

7. Плазмидна екстракция. Плазмидната екстракция често използва Рназа за разграждане на РНК и остатъчната Рназа трябва да се усвои с Протеиназа К и да се екстрахира чрез PCI.

8. Съхранение на РНК Дори ако се съхранява при ниска температура, следи от РНКаза ще причинят разграждане на РНК.Най-доброто решение за дълготрайно запазване на РНК е сол/алкохолна суспензия, тъй като алкохолът инхибира цялата ензимна активност при ниски температури.

9. Когато катиони (Ca, Mg) съдържат тези йони, нагряването при 80°C за 5 минути ще доведе до разцепване на РНК, така че ако РНК трябва да се нагрее, консервиращият разтвор трябва да съдържа хелатиращ агент (1mM натриев цитрат, pH 6,4).

10. Ензимите, използвани в следващите експерименти, могат да бъдат замърсени с РНКаза.

10 съвета за извличане на РНК

1: Бързо предотвратяване на активността на RNase.Пробите се замразяват бързо след събиране и РНКазата се инактивира чрез бърза операция по време на лизис.

2: Изберете подходящ метод за екстракция за тъкан с високо съдържание на рибозим, а мастната тъкан е най-добре да използвате метода, съдържащ фенол.

3: Качеството на прогнозиране изисква Northern, изграждането на cDNA библиотека изисква висока цялост, а RT-PCR и RPA (тест за защита на рибонуклеаза) не изискват висока цялост.RT-PCR изисква висока чистота (остатъци от ензимен инхибитор).

4: Пълната хомогенизация е ключът към подобряване на добива и намаляване на разграждането.

5: Проверете целостта на откриването на РНК електрофореза, 28S: 18S = 2: 1 е пълен знак, 1: 1 също е приемливо за повечето експерименти.

6: Отстраняване на ДНК за RT-PCR, масивен анализ Най-добре е да използвате Dnase I за отстраняване на ДНК.

7: Намаляване на замърсяването с екзогенни ензими – ензимите не могат да се внасят отвън.

8: Когато се концентрира нуклеинова киселина с ниска концентрация, трябва да се добави реагент за съвместно утаяване.Но за да се предотврати замърсяването на ко-утаителя, съдържащ ензими и ДНК.

9: Разтворете старателно РНК, ако е необходимо, загрейте при 65°С за 5 минути.

подходящ метод за съхранение

Може да се съхранява при –20C за кратко време и при –80C за дълго време.Първата стъпка в подобряването на добива на РНК е да се разбере, че съдържанието на РНК в различните проби варира значително.Високо съдържание (2-4ug/mg) като черен дроб, панкреас, сърце, средно изобилие (0,05-2ug/mg) като мозък, ембрион, бъбрек, бял дроб, тимус, яйчници, ниско съдържание (<0,05ug/mg) mg) като пикочен мехур, кости, мазнини.

1: Лизирайте клетки за освобождаване на RN – ако РНК не се освободи, добивът ще бъде намален.Електрическата хомогенизация работи по-добре от другите методи за хомогенизиране, но може също да се наложи да се комбинира с други методи, като смесване с течен азот, ензимно смилане (лизозим/литиказа)

2: Оптимизиране на метода на екстракция.Най-големите проблеми с методите, базирани на фенол, са непълната стратификация и частичната загуба на РНК (супернатантата не може да бъде напълно отстранена).Непълната стратификация се дължи на високото съдържание на нуклеинова киселина и протеин, което може да бъде разрешено чрез увеличаване на количеството на използвания лизат или намаляване на количеството на пробата.Етап на екстракция с хлороформ се добавя към мастната тъкан.Загубата на РНК може да бъде намалена чрез обратно изпомпване или чрез отстраняване на органичния слой, последвано от центрофугиране.Най-големият проблем при методите, базирани на колонно центрофугиране, е излишната проба.

Класически съвети за извличане

1. Пречистване на фенол: Добавете равен обем 1:1 фенол/хлороформ и разбъркайте енергично за 1-2 минути.Центрофугирайте на висока скорост за 2 минути.Внимателно отстранете супернатантата (80-90%).Никога не стигайте до средния слой.Равен обем от реакционния разтвор може да се добави към фенол/хлороформ и супернатантата да се отстрани.Двете супернатанти могат да бъдат смесени заедно за утаяване на нуклеинова киселина, за да се подобри добивът.Не бъдете прекалено нежни, когато смесвате и не се опитвайте да отстраните целия супернатант.

2. Промиване със 70-80% етанол: По време на промиването нуклеиновата киселина трябва да се суспендира, за да се гарантира, че остатъчната сол е отмита.В същото време, веднага след изливането на етанола, центрофугирайте на висока скорост за няколко секунди и след това отстранете остатъчния етанол с пипета.Разтваря се след престояване на стайна температура 5-10 минути.

11. Извличане на специални организации

1. Фиброзна тъкан: Ключът към извличането на РНК от фиброзна тъкан като сърдечен/скелетен мускул е пълното разрушаване на тъканта.Тези тъкани имат ниска клетъчна плътност, така че количеството РНК на единица тегло тъкан е ниско и е най-добре да се използва възможно най-голямо начално количество.Не забравяйте да смилате тъканта старателно при условия на замръзване.

2. Тъкани с високо съдържание на протеини/мазнини: съдържанието на мозъчни/растителни мазнини е високо.След PCI екстракция, супернатантата съдържа бели флокули.Супернатантата трябва да се екстрахира повторно с хлороформ.

3. Тъкани с високо съдържание на нуклеинова киселина/рибозим: далакът/тимусът има високо съдържание на нуклеинова киселина и рибозим.Смилането на тъкан при условия на замразяване, последвано от бърза хомогенизация, може ефективно да инактивира рибозимите.Въпреки това, ако лизатът е твърде вискозен (поради високо съдържание на нуклеинова киселина), PCI екстракцията няма да може да се стратифицира ефективно;добавянето на повече лизат може да разреши този проблем.Множество PCI екстракции могат да премахнат повече остатъчна ДНК.Ако веднага след добавянето на алкохол се образува бяла утайка, това показва ДНК замърсяване.Повторната екстракция с кисела PCI след разтваряне може да отстрани ДНК замърсяването.

4. Растителна тъкан: Растителната тъкан е по-сложна от животинската.Обикновено растенията се смилат в условия на течен азот, така че разграждането на РНК от ендогенни ензими е необичайно.Ако проблемът с разграждането не е разрешен, почти сигурно е причинен от примеси, съдържащи се в пробата.Примесите, съдържащи се в много растения, ще доведат до остатъци и причината за остатъците често е, защото тези примеси имат някои прилики с РНК: вие се утаявате и аз се утаявам, и вие адсорбирате и аз адсорбирам.Тези характеристики определят, че те са много силни ензимни инхибитори.

Понастоящем търговските реагенти за екстракция на РНК могат да бъдат адаптирани към почти всички животински тъкани с малки корекции, но има малко търговски реагенти за екстракция на РНК, които могат да бъдат подходящи за повечето растителни тъкани.За щастие Foregene може да предостави специалникомплекти за екстракция на растителна РНК, ние имамеКомплект за изолиране на обща растителна РНК, Plant Total RNA Isolation kit Plus.Последният е специално създаден за растения с високо съдържание на полизахариди и полифеноли.За екстракцията на РНК обратната връзка от лабораторните потребители е особено добра.

12. Ефектът от замразяването и размразяването на пробата Замразената проба може да е по-голяма и трябва да се нареже, преди да се използва за екстракция на РНК.Пробите са склонни да се стопят (евентуално частично) по време на рязане.Замразените проби може да се наложи да бъдат претеглени преди екстракцията на РНК и размразяването определено ще настъпи по време на този процес.Понякога размразяването на пробата става и по време на процеса на смилане с течен азот;или замразената проба се добавя директно към лизата без смилане с течен азот и размразяването определено ще настъпи преди пълната хомогенизация.Експериментите показват, че замразената тъкан е по-склонна към разграждане на РНК по време на размразяване, отколкото свежата тъкан.Вероятната причина: Процесът на замразяване-размразяване разрушава структурите в клетката, което улеснява ендогенните ензими да влязат в директен контакт с РНК.

13. Преценка на качеството на РНК Обикновено електрофорезата се използва за преценка на целостта на РНК, а A260/A280 се използва за преценка на чистотата на РНК.На теория интактната РНК има съотношение 28S:18S = 2,7:1 и повечето данни подчертават съотношението 28S:18S = 2:1.Факт е, че почти никоя от РНК, извлечена от проби, различни от клетки, не е в съотношение 2:1 (това е получено с помощта на Agilent Bioanalyzer).

Резултатите от електрофорезата на РНК се влияят от много фактори, включително вторична структура, условия на електрофореза, натоварване на пробата, степен на насищане с EB и т.н. Използвайте нативна електрофореза за откриване на РНК и използвайте ДНК маркер като контрола.Ако 28S при 2kb и 18S при 0,9kb са чисти и 28S: 18S > 1, целостта може да отговори на изискванията на повечето следващи експерименти.

A260/A280 е индикатор, който предизвика много объркване.На първо място е необходимо да се изясни първоначалното значение на този показател за нуклеиновите киселини: чиста РНК, нейните A260/280 = около 2,0.Чистата РНК е „причината“, а A260/A280 = 2 е „следствието“.Сега всички използват A260/A280 като „причина“, мислейки, че „ако A260/A280 = 2, тогава РНК е чиста“, което естествено води до объркване.

Ако се интересувате, можете да добавите малко реагент, който често се използва при екстракция, като фенол, гуанидин изотиоцианат, PEG и др., към вашата РНК проба и след това да измерите съотношението A260/A280.Реалността е, че много от реагентите, използвани за екстракция на РНК, както и много примеси в пробата, абсорбират около A260 и A280, засягайки A260/A280.

Най-поучителният подход в момента е да се сканират РНК проби в диапазона 200-300 nm.Кривата на чистата РНК има следните характеристики: кривата е гладка, A230 и A260 са две инфлексни точки, A300 е близо до 0, A260/A280 = около 2.0 и A260/A230 = около 2.0.Ако данните от сканирането не са налични, съотношението A260/A230 също трябва да се определи, тъй като това съотношение е по-чувствително към пренасяне на всички примеси, които влияят на ензимната реакция.Вземете предвид линейния обхват на устройството (0,1–0,5 за A260).

Има две други полезни явления: съотношението ще бъде с около 0,3 по-ниско, когато A260/A280 се измерва във вода;докато съотношението, измерено в 10 mM EDTA, е около 0,2 по-високо от това, измерено в 1 mM EDTA.

Свързани продукти:

Производител и доставчик на комплект за изолиране на тотална РНК в Китай |Foregene (foreivd.com)

Доставчици и фабрика за изолиране на РНК |Производители на серии за изолиране на РНК в Китай (foreivd.com)

Серия за изолиране на РНК – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)