RT-qPCR експериментът включва извличане на РНК и оценка на качеството, обратна транскрипция и qPCR три стъпки, всяка стъпка има много предпазни мерки, които ще представим подробно по-долу.

Ⅰ.Оценка на качеството на РНК

При RT-qPCR експеримент, след завършване на екстракцията на РНК, качеството на РНК трябва да бъде оценено и последващият експеримент може да се проведе само след като бъде квалифициран.Методите за оценка включват спектрофотометър, гел електрофореза на Agilent, анализ на Agilent 2100, сред които най-често използваният спектрофотометър и метод за откриване на електрофореза в агарозен гел.Трябва да се отбележи, че тези два метода трябва да се използват заедно за завършване на откриването и анализа на концентрацията, чистотата и целостта на РНК, така че да се гарантира качеството на РНК.

Свързан комплект за изолиране на РНК: 

Комплект за изолиране на обща РНК клетка

Високо пречистена и висококачествена обща РНК може да бъде получена от различни култивирани клетки за 11 минути.

Комплект за изолиране на тотална РНК от животни

Бързо и ефикасно извличане на обща РНК с висока чистота и високо качество от различни животински тъкани.

Спектрофотометър:

Спектрофотометърът се използва главно за определяне на концентрацията и чистотата на РНК, но не може да открие целостта на РНК и геномния остатък.Сред тях A260/280 и A260/230 са важни параметри за откриване на чистотата на РНК и чистотата на РНК може да бъде открита според колебанията на техните стойности:

1. 1.9 < A260/280 < 2.1, което показва, че чистотата на РНК е добра;A260/280<1.9, което показва, че може да има протеинов остатък в РНК;A260/280>2.1, което показва възможно частично разграждане на РНК, което може да бъде допълнително потвърдено чрез електрофореза в агарозен гел.

2. 2.0 < A260/230 < 2.2, което показва, че чистотата на РНК е добра;A260/230< 2,0, което показва, че може да има остатъци от органични реагенти в РНК, като феноли, етанол или захари.

Електрофореза в агарозен гел:

Анализът с електрофореза в агарозен гел може да анализира целостта на РНК, генома и протеиновите остатъци, но не може точно да определи количествено концентрацията на РНК или да открие остатъците от органични реагенти.Вземете например еукариотни РНК шаблони:

1. РНК се подлага на електрофореза в агарозен гел.Ако имаше само три единични ленти от 28sRNA, 18sRNA и 5.8sRNA на картата на гела, това показва, че извлечената РНК е непокътната.Ако има феномен на влачене, това показва частично разграждане на РНК.

2. Ако има една ярка ивица между отвора за лепило и лентата 28sRNA, може да има остатък от геномна ДНК.

3. Ако в отвора за лепило се появят ленти, това означава, че може да има остатъци от протеини и други макромолекулни вещества.

Ⅱ. Обратна транскрипция

След като екстракцията на РНК приключи, тя трябва да бъде обърната в cDNA за последващи експерименти, така че стъпката на обръщане е от съществено значение.Обратната транскрипция ще бъде въведена от селекцията на обратна транскриптаза и праймер:

Избор на обратна транскриптаза:

Типичните обратни транскриптази включват AMV RTase и MMLV RTase.RNase H на AMV RTase има силна активност, къса дължина на синтеза, ниско количество на синтез и добра термична стабилност (42 ~ 55 ℃).Активността на RNase H на MMLV RTase е слаба, дължината на синтеза е дълга, количеството на синтез е високо и термичната стабилност е лоша (37 ~ 42 ℃).

Тъй като RNase H ензимът има функцията да разгражда РНК шаблон, MMLV със слаба активност на RNase H трябва да бъде преференциално избран по време на обратната транскрипция и след по-късно генно инженерство термичната стабилност на MMLV е достигнала качествен скок.Приемане на ForegeneForeasy обратна транскриптаза (M-MLV за обратна транскрипция) като пример, това е нова обратна транскриптаза, експресирана в бактерии, създадени от E. coli, използвайки технология за генетична рекомбинация.Това е рекомбинантна ДНК полимераза, която синтезира комплементарна ДНК верига от едноверижна РНК, ДНК или хибрид РНК:ДНК.Той няма активност на РНКаза Н, силна стабилност, силен афинитет към РНК и висока чувствителност на откриване.

 

Foreasy обратна транскриптаза (M-MLV за обратна транскрипция)

Избор на грунд:

Обикновено RT праймерите попадат в три категории: олиго dT, произволни праймери и ген-специфични праймери.Изберете подходящи праймери за използване според различните експериментални изисквания.

1. Ако матрицата е от еукариотен произход и късната cDNA се използва за рутинна PCR амплификация, се препоръчва Oligo (dT);Ако последващият експеримент се използва само за qPCR, Oligo (dT) се препоръчва да се смеси с произволни праймери, за да се подобри ефективността на обратната транскрипция.

2. Ако шаблонът е от прокариоти, трябва да се изберат произволни праймери или генно специфични праймери за обратна транскрипция.

Ⅲ.qPCR

Количественото определяне на флуоресценцията е разработено главно от избора на количествени методи, принципи на проектиране на праймера, избор на ROX, конфигурация на реакционната система и настройка на реакционните условия и др.

Избор на количествени методи:

Количествените методи се делят на относителни количествени методи и абсолютни количествени методи.Относителното количествено определяне може да се използва за откриване на ефекта на определени методи на лечение върху генната експресия, за откриване на разликата в генната експресия в различни моменти и сравняване на разликата в генната експресия в различни тъкани.Абсолютното количествено определяне може да открие количеството нуклеинова киселина във вируса и т.н.Когато правим експерименти, трябва да изберем подходящите количествени методи според нашите собствени експерименти.

Принципи на проектиране на грунд:

Дизайнът на праймера за qPCR е пряко свързан с ефективността на амплификацията и специфичността на продукта.Следователно, правилното проектиране на добри праймери е първата стъпка за успешен qPCR.При проектирането на грунд трябва да се обърне внимание на следните принципи, когато се спазва принципът на конвенционалния дизайн на грунд:

1. Дължината на целевия фрагмент се контролира между 100 и 300 bp;

2. Крос-екзон дизайн за избягване на влиянието на геномната ДНК;

3. Проектираните праймери трябва да бъдат тествани за ефективност на амплификация и само когато ефективността на амплификация достигне стандарта (90-110%), те могат да бъдат използвани за количествени експерименти;

4. Концентрацията на праймера обикновено се оптимизира между 0,1uM и 1,0uM.

Избор наROX:

В процеса на количествена реакция ROX може равномерно да коригира разликата в оптичния път, грешката при пипетиране или разликата в обема, причинена от изпарение и кондензация, подобрявайки повторяемостта на резултатите.Все пак трябва да се отбележи, че изборът на ROX е свързан с инструмента.Ако инструментът qPCR има функцията за автоматично коригиране на разликата между отворите, не е необходимо да добавя ROX;в противен случай трябва да добави ROX корекция.Малките партньори при закупуване на реагенти трябва да бъдат в съответствие с използвания инструмент, за да изберат правилния ROX, избягвайте по-късни грешки.

Подготовка на реакционната система:

Предпочитат се реакционни обеми от 20 ul и 50 ul.Когато се формулира системата, трябва да се обърне внимание на следните въпроси:

1. Реакционната система трябва да бъде подготвена чрез вентилация в ултрачистата работна маса, нов ddH₂O се използва за всеки експеримент;

2. Всеки експеримент трябва да подготви NTC, за да провери дали има замърсяване в системата, и всяка двойка праймери трябва да направи NTC, когато подготвя системата;

3. За да се установи дали има gDNA остатък в матрицата на РНК, NRT може да се подготви за всяка проба за откриване;

4. При подготовката на системата е препоръчително да се направят поне 3 технически повторения за една проба;

5. Когато матрицата е cDNA, препоръчва се разреждане 5-10 пъти, за да се намали ефектът на инхибиране на системата за обратна транскрипция върху qPCR експеримента.По-добре е да изследвате количеството на шаблона по градиент, така че стойността на CT да пада между 20-30;

6. Определете необходимия брой реакции, увеличете с 5-10% въз основа на броя на реакциите и изчислете броя на конфигурацията на обема;

7, системата се приготвя с помощта на принципа на предварително смесване, смесване след центрофугиране и гарантиране на мехурчета;

8, Доколкото е възможно да изберете поддържащи консумативи.

Свързан комплект RT-qPCR