Флуоресцентната количествена PCR (известна също като TaqMan PCR, наричана по-нататък FQ-PCR) е нова технология за количествено определяне на нуклеинова киселина, разработена от PE (Perkin Elmer) в Съединените щати през 1995 г. Тази технология се основава на конвенционална PCR чрез добавяне на флуоресцентно маркирани сонди.В сравнение с гъвкавата PCR, FQ-PCR има много предимства за реализиране на своята количествена функция.Тази статия има за цел да опише накратко характеристиките, принципите, методите и приложенията на технологията.
1 Характеристики
FQ-PCR не само има високата чувствителност на обикновената PCR, но и поради прилагането на флуоресцентни сонди, може директно да открие промяната на флуоресцентния сигнал по време на PCR амплификация чрез фотоелектричната проводяща система, за да получи количествени резултати, което преодолява много недостатъци на конвенционалната PCR, така че също така има висока специфичност на ДНК хибридизацията и високата точност на спектроскопската технология.
Например, общите PCR продукти трябва да се наблюдават чрез електрофореза в агарозен гел и оцветяване с етидиев бромид с ултравиолетова светлина или чрез електрофореза в полиакриламиден гел и оцветяване със сребро.Това изисква не само множество инструменти, но и време и усилия.Използваният етидиев бромид за оцветяване е вреден за човешкото тяло и тези сложни експериментални процедури предоставят възможности за замърсяване и фалшиви положителни резултати.FQ-PCR обаче трябва да отвори капака само веднъж по време на зареждането на пробата и последващият процес е работа в напълно затворена епруветка, която не изисква PCR последваща обработка, като се избягват много недостатъци при конвенционалните PCR операции.Експериментът обикновено използва термоциклер ABI7100 PCR, разработен от PE компания.
Инструментът има следните характеристики: ① Широко приложение: Може да се използва за количествено определяне на ДНК и РНК PCR продукти, изследване на генната експресия, откриване на патогени и оптимизиране на PCR условията.② Уникален количествен принцип: Използвайки флуоресцентно белязани сонди, количеството флуоресценция ще се натрупа с PCR цикъла след лазерно възбуждане, така че да се постигне целта на количественото определяне.③ Висока работна ефективност: Вграден термоциклер 9600 PCR, компютърно контролиран 1 до 2 часа за завършване на амплификацията и количественото определяне на 96 проби автоматично и синхронно.④ Няма нужда от гел електрофореза: Няма нужда от разреждане и електрофореза на пробата, просто използвайте специална сонда за откриване директно в реакционната тръба.⑤Без замърсяване в тръбопровода: Използват се уникалната напълно затворена реакционна тръба и фотоелектрическа проводяща система, така че няма нужда да се притеснявате за замърсяване.⑥Резултатите са възпроизводими: количественият динамичен обхват е до пет порядъка.Следователно, тъй като тази технология е успешно разработена, тя е оценена от много научни изследователи и е приложена в много области.
2 Принципи и методи
Принципът на работа на FQ-PCR е да се използва 5′→3′ екзонуклеазната активност на ензима Taq за добавяне на флуоресцентно белязана проба към PCR реакционната система.Сондата може специфично да хибридизира с ДНК матрицата, съдържаща се в праймерната последователност.5′-краят на сондата е маркиран с гена за флуоресцентна емисия FAM (6-карбоксифлуоресцеин, пик на флуоресцентна емисия при 518nm), а 3′-краят е белязан с групата за потушаване на флуоресценцията TAMRA (6-карбокситетраметилродамин, пик на флуоресцентна емисия при 582nm), 3′-началото на сондата е фосфорилиран, за да предотврати удължаване на сондата по време на PCR амплификация.Когато сондата остане непокътната, гасителната група потиска флуоресцентното излъчване на излъчващата група.След като излъчващата група се отдели от охлаждащата група, инхибирането се премахва и оптичната плътност при 518 nm се увеличава и се открива от системата за откриване на флуоресценция. Във фазата на ренатурация сондата хибридизира с шаблонната ДНК и ензимът Taq във фазата на удължаване се движи по протежение на ДНК матрицата с удължаването на праймера.Когато сондата бъде прекъсната, ефектът на охлаждане се освобождава и флуоресцентният сигнал се освобождава.Всеки път, когато шаблонът се копира, сондата се прекъсва, придружена от освобождаване на флуоресцентен сигнал.Тъй като има връзка едно към едно между броя на освободените флуорофори и броя на PCR продуктите, тази техника може да се използва за точно количествено определяне на шаблона.Експерименталният инструмент обикновено използва термоциклер ABI7100 PCR, разработен от PE компания, като могат да се използват и други термоциклери.Ако за експеримента се използва реакционна система тип реакция ABI7700, след приключване на реакцията, количествените резултати могат да бъдат директно дадени чрез компютърен анализ.Ако използвате други термични циклери, трябва да използвате флуоресцентен детектор, за да измерите флуоресцентния сигнал в реакционната тръба в същото време, за да изчислите RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ представлява съотношението на интензитета на луминесценция на групата флуоресцентни емисии на епруветката с пробата към интензитета на луминесценция на групата за охлаждане, RQ- представлява съотношението на двете в празната епруветка, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) представлява количеството промяна на флуоресцентния сигнал по време на PCR. След обработка на данните могат да се получат количествени резултати.Благодарение на въвеждането на флуоресцентни сонди, специфичността на експеримента е значително подобрена.Дизайнът на сондата обикновено трябва да отговаря на следните условия: ①Дължината на сондата трябва да бъде около 20-40 бази, за да се гарантира специфичността на свързването.②Съдържанието на GC бази е между 40% и 60%, за да се избегне дублиране на единични нуклеотидни последователности.③ Избягвайте хибридизация или припокриване с праймери.④ Стабилността на свързването между сондата и шаблона е по-голяма от стабилността на свързването между праймера и шаблона, така че стойността на Tm на сондата трябва да бъде поне 5°C по-висока от стойността на Tm на праймера.В допълнение, концентрацията на сондата, хомологията между сондата и шаблонната последователност и разстоянието между сондата и праймера оказват влияние върху експерименталните резултати.
Свързани продукти:
Китай PCR в реално време Easyᵀᴹ-Taqman Производител и доставчик |Foregene (foreivd.com)
Време на публикуване: 15 октомври 2021 г
