RT-qPCR е разработен от обикновена PCR технология.Той добавя флуоресцентни химикали (флуоресцентни багрила или флуоресцентни сонди) към традиционната PCR реакционна система и открива процеса на отгряване и удължаване на PCR в реално време според техните различни луминесцентни механизми.Промените на флуоресцентния сигнал в средата се използват за изчисляване на количеството промяна на продукта във всеки цикъл на PCR.В момента най-разпространените методи са методът с флуоресцентно багрило и методът на сондата.

Метод на флуоресцентно багрило:
Някои флуоресцентни багрила, като SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO и т.н., не излъчват светлина сами по себе си, но излъчват флуоресценция след свързване с малката бразда на dsDNA.Следователно, в началото на PCR реакцията, машината не може да открие флуоресцентния сигнал.Когато реакцията премине към отгряване-удължаване (метод в две стъпки) или етап на удължаване (метод в три стъпки), двойните вериги се отварят по това време и новата ДНК полимераза По време на синтеза на веригата флуоресцентните молекули се комбинират в малката бразда на dsDNA и излъчват флуоресценция.Тъй като броят на PCR циклите се увеличава, все повече и повече багрила се комбинират с dsDNA и флуоресцентният сигнал също непрекъснато се усилва.Вземете SYBR Green Ⅰ като пример.
Метод на сондата:
Сондата Taqman е най-често използваната сонда за хидролиза.Има флуоресцентна група в 5' края на сондата, обикновено FAM.Самата сонда е последователност, комплементарна на целевия ген.Има флуоресцентна гасителна група в 3' края на флуорофора.Съгласно принципа на флуоресцентен резонансен пренос на енергия (Förster resonance energy transfer, FRET), когато репортерната флуоресцентна група (донорна флуоресцентна молекула) и охлаждащата флуоресцентна група (акцепторна флуоресцентна молекула) Когато спектърът на възбуждане се припокрива и разстоянието е много близко (7-10nm), възбуждането на донорната молекула може да индуцира флуоресценцията на акцепторната молекула, докато автофлуоресценцията е отслабена.Следователно, в началото на PCR реакцията, когато сондата е свободна и непокътната в системата, репортерната флуоресцентна група няма да излъчва флуоресценция.При отгряване праймерът и сондата се свързват с шаблона.По време на етапа на удължаване полимеразата непрекъснато синтезира нови вериги.ДНК полимеразата има 5'-3' екзонуклеазна активност.Когато достигне сондата, ДНК полимеразата ще хидролизира сондата от матрицата, ще отдели репортерната флуоресцентна група от гасителната флуоресцентна група и ще освободи флуоресцентния сигнал.Тъй като има връзка едно към едно между сондата и шаблона, методът на сондата е по-добър от метода на багрилото по отношение на точността и чувствителността на теста.

Фигура 1 Принцип на qRT-PCR

Грунд дизайн
Принципи:

Праймерите трябва да бъдат проектирани в запазената област на серията нуклеинова киселина и да имат специфичност.

Най-добре е да се използва cDNA последователност и mRNA последователност също е приемлива.Ако не, разберете дизайна на cds региона на ДНК последователността.
Дължината на флуоресцентния количествен продукт е 80-150 bp, най-дългият е 300 bp, дължината на праймера обикновено е между 17-25 бази и разликата между праймерите нагоре и надолу по веригата не трябва да е твърде голяма.

Съдържанието на G+C е между 40% и 60%, а 45-55% е най-доброто.
Стойността на ТМ е между 58-62 градуса.
Опитайте се да избягвате димери на праймери и самодимери, (не се появяват повече от 4 двойки последователни комплементарни бази) структура на фиби, ако е неизбежна, направете ΔG<4,5kJ/mol* Ако не можете да гарантирате, че gDNA е била премахната по време на обратна транскрипция Чисто, най-добре е да проектирате праймерите на интрона *3' краят не може да бъде модифициран и за да избегнете AT, GC богати региони, избягвайте T/C, A/G непрекъсната структура (2-3) праймера и не-
специфична Хомологията на хетерогенно амплифицираната последователност е за предпочитане по-малка от 70% или има хомология на 8 комплементарни бази.
База данни:
CottonFGD търсене по ключови думи
Дизайн на грунд:
Дизайн на IDT-qPCR праймер

Фигура 2 IDT страница с онлайн инструмент за проектиране на грунд

Фиг.3 показване на страница с резултати
Дизайн на lncRNA праймери:
lncRNA:същите стъпки като иРНК.
миРНК:Принципът на метода на стволовата бримка: Тъй като всички miPHK са къси последователности от около 23 nt, не може да се извърши директно PCR откриване, така че се използва инструментът за последователност на стволовата бримка.Последователността на стволовата верига е едноверижна ДНК от около 50 nt, която може сама да образува структура на фиби.3 „Краят може да бъде проектиран като последователност, комплементарна на частичния фрагмент на miPHK, тогава целевата miPHK може да бъде свързана към последователността на стволовата верига по време на обратна транскрипция и общата дължина може да достигне 70 bp, което е в съответствие с дължината на амплифицирания продукт, определен от qPCR.Проектиране на праймер за миРНК на опашка.
Специфично за усилване откриване:
Онлайн база данни за бласт: CottonFGD бласт по сходство на последователността
Локален взрив: Вижте използването на Blast+ за извършване на локален взрив, linux и macos могат директно да създадат локална база данни, системата win10 може да се направи и след инсталиране на ubuntu bash.Създайте локална база данни за взрив и локален взрив;отворете ubuntu bash на win10.
Забележка: Памукът от планините и памукът от морски острови са тетраплоидни култури, така че резултатът от взрива често ще бъде две или повече съвпадения.В миналото използването на NAU cds като база данни за извършване на взрив вероятно ще намери два хомоложни гена само с няколко SNP разлики.Обикновено двата хомоложни гена не могат да бъдат разделени чрез дизайн на праймера, така че те се третират като еднакви.Ако има очевиден индел, праймерът обикновено се проектира върху индела, но това може да доведе до вторична структура на праймера. Свободната енергия става по-висока, което води до намаляване на ефективността на усилване, но това е неизбежно.

Откриване на вторична структура на праймера:
стъпки:отворете олиго 7 → въведете шаблонна последователност → затворете подпрозорец → запазете → намерете праймера върху шаблона, натиснете ctrl+D, за да зададете дължина на праймера → анализирайте различни вторични структури, като тяло на самодимеризация, хетеродимер, фиби, несъответствие и т.н. Последните две снимки на Фигура 4 са резултатите от теста на праймерите.Резултатът от предния праймер е добър, няма очевидна структура на димер и фиби, няма непрекъснати допълващи се бази и абсолютната стойност на свободната енергия е по-малка от 4,5, докато задният праймер показва непрекъснатост. 6-те бази са допълващи се, а свободната енергия е 8,8;в допълнение, по-сериозен димер се появява в 3' края и се появява димер от 4 последователни бази.Въпреки че свободната енергия не е висока, 3' димерът Chl може сериозно да повлияе на специфичността на усилването и ефективността на усилването.Освен това е необходимо да се провери за фиби, хетеродимери и несъответствия.

Фигура 3 резултати от откриване на олиго7
Откриване на ефективност на усилване:
Ефективността на амплификацията на PCR реакцията сериозно влияе върху резултатите от PCR.Също така при qRT-PCR ефективността на амплификация е особено важна за количествените резултати.Отстранете други вещества, машини и протоколи в реакционния буфер.Качеството на праймерите също има голямо влияние върху ефективността на амплификацията на qRT-PCR.За да се гарантира точността на резултатите, както количественото определяне на относителната флуоресценция, така и количественото определяне на абсолютната флуоресценция трябва да открият ефективността на амплификация на праймерите.Признава се, че ефективната ефективност на qRT-PCR амплификация е между 85% и 115%.Има два метода:
1. Метод на стандартната крива:
а.Смесете cDNA
b.Градиентно разреждане
c.qPCR
д.Уравнение на линейна регресия за изчисляване на ефективността на усилване
2. LinRegPCR
LinRegPCR е програма за анализ на RT-PCR данни в реално време, наричани още количествени PCR (qPCR) данни, базирани на SYBR Green или подобна химия.Програмата използва коригирани данни без базова линия, извършва корекция на базовата линия за всяка проба отделно, определя прозорец на линейност и след това използва линеен регресионен анализ, за ​​да пасне на права линия през набора от PCR данни.От наклона на тази линия се изчислява PCR ефективността на всяка отделна проба.Средната ефективност на PCR за ампликон и стойността на Ct за проба се използват за изчисляване на начална концентрация за проба, изразена в произволни флуоресцентни единици.Въвеждането и извеждането на данни става чрез електронна таблица в Excel.Само проба
необходимо е смесване, без градиент
необходими са стъпки:(Вземете Bole CFX96 като пример, не съвсем машина с ясен ABI)
експеримент:това е стандартен qPCR експеримент.
qPCR изходни данни:LinRegPCR може да разпознае две форми на изходни файлове: RDML или резултат от количествено усилване.Всъщност това е стойността на откриване в реално време на броя на цикъла и флуоресцентния сигнал от машината, а усилването се получава чрез анализиране на стойността на промяна на флуоресценцията на ефективността на линейния сегмент.
Избор на данни: На теория RDML стойността трябва да може да се използва.Изчислено е, че проблемът на моя компютър е, че софтуерът не може да разпознае RDML, така че имам изходната стойност на Excel като оригинални данни.Препоръчва се първо да се извърши груб скрининг на данните, като например неуспешно добавяне на проби и т.н. Точките могат да бъдат изтрити в изходните данни (разбира се, не можете да ги изтриете, LinRegPCR ще игнорира тези точки на по-късен етап)

Фигура 5 Експортиране на qPCR данни

Фиг.6 избор на кандидат проби

Въвеждане на данни:Отворете qualification amplification results.xls, → отворете LinRegPCR → файл → прочетете от excel → изберете параметри, както е показано на Фигура 7 → OK → щракнете върху определяне на базовите линии

Фиг.7 стъпки за въвеждане на данни от linRegPCR

Резултат:Ако няма повторение, не е необходимо групиране.Ако има повторение, групирането може да се редактира в групирането на извадката и името на гена се въвежда в идентификатора, след което същият ген ще бъде автоматично групиран.Накрая щракнете върху файла, експортирайте excel и вижте резултатите.Ефективността на усилване и резултатите от R2 за всяка ямка ще бъдат показани.Второ, ако се разделите на групи, ще се покаже коригираната средна ефективност на усилване.Уверете се, че ефективността на усилване на всеки праймер е между 85% и 115%.Ако е твърде голям или твърде малък, това означава, че ефективността на усилване на праймера е лоша.

Фигура 8 Резултат и изходни данни

Експериментален процес:
Изисквания за качество на РНК:
Чистота:1.72.0 показва, че може да има остатъчен изотиоцианат.Чистата нуклеинова киселина A260/A230 трябва да бъде около 2. Ако има силна абсорбция при 230 nm, това показва, че има органични съединения като фенатни йони.В допълнение, той може да бъде открит чрез електрофореза с 1,5% агарозен гел.Насочете маркера, тъй като ssRNA няма денатурация и логаритъмът на молекулното тегло няма линейна връзка и молекулното тегло не може да бъде правилно изразено.Концентрация: Теоретичнонепо-малко от 100 ng/ul, ако концентрацията е твърде ниска, чистотата обикновено е ниска, а не висока

Фигура 9 РНК гел

Освен това, ако пробата е ценна и концентрацията на РНК е висока, се препоръчва да се направи аликвотна част след екстракцията и да се разреди РНК до крайна концентрация от 100-300 ng/ul за обратна транскрипция.впроцес на обратна транскрипция, когато иРНК се транскрибира, олиго (dt) праймери, които могат специфично да се свържат с полиА опашките, се използват за обратна транскрипция, докато lncRNA и circRNA използват произволни хексамерни (Random 6 mer) праймери за обратна транскрипция на обща РНК. За miRNA, miRNA-специфични праймери на врата се използват за обратна транскрипция.Много компании вече пуснаха специални комплекти за опаковане.За метода на стволовата бримка, методът на опашката е по-удобен, с висока пропускателна способност и спестяване на реагенти, но ефектът от разграничаването на miPHK от едно и също семейство не трябва да бъде толкова добър, колкото метода на стволовата бримка.Всеки комплект за обратна транскрипция има изисквания за концентрацията на ген-специфични праймери (стволови бримки).Вътрешната референция, използвана за miRNA, е U6.В процеса на обръщане на стебло-контур, тръба от U6 трябва да се обърне отделно и предният и задният праймери на U6 трябва да се добавят директно.Както circRNA, така и lncRNA могат да използват HKG като вътрешна референция.вcDNA откриване,
ако няма проблем с РНК, сДНК също трябва да е наред.Въпреки това, ако се преследва съвършенството на експеримента, най-добре е да се използва вътрешен референтен ген (референтен ген, RG), който може да различи gDNA от cds.Като цяло RG е домакински ген., HKG), както е показано на фигура 10;По това време правех протеин за съхранение на соя и използвах актин7, съдържащ интрони, като вътрешна референция.Размерът на амплифицирания фрагмент на този праймер в gDNA е 452 bp, а ако cDNA се използва като шаблон, той е 142 bp.След това резултатите от теста установиха, че част от cDNA всъщност е замърсена от gDNA и също така доказа, че няма проблем с резултата от обратната транскрипция и може да се използва като шаблон за PCR.Безполезно е да се провежда електрофореза в агарозен гел директно с кДНК и това е дифузна лента, което не е убедително.

Фигура 10 cDNA откриване

Определяне на условията на qPCRобикновено няма проблем според протокола на комплекта, главно в стъпката на tm стойността.Ако някои праймери не са добре проектирани по време на проектирането на праймера, което води до голяма разлика между стойността tm и теоретичните 60°C, се препоръчва cDNA След като пробите се смесят, изпълнете градиентна PCR с праймери и се опитайте да избегнете настройката на температурата без ленти като TM стойност.

Анализ на данни

Конвенционалният метод за количествена PCR обработка на относителна флуоресценция е основно съгласно 2-ΔΔCT.Шаблон за обработка на данни.

Свързани продукти:

Лесен PCR в реално време^TM – Такман

Лесен PCR в реално време^TM – SYBR GREEN I

RT Easy I (главен премикс за синтез на сДНК на първата верига)

RT Easy II (главен премикс за синтез на сДНК на първата верига за qPCR)