Специфика на откриване

В повечето случаи целта на дизайна на праймера е да се увеличи максимално специфичността на PCR.Това се определя от повече или по-малко предвидимото влияние на много променливи.Една важна променлива е последователността в 3′-края на праймера.

Важно е, че PCR анализите, предназначени за специфичност, е по-вероятно да поддържат висока ефективност в широк динамичен диапазон, тъй като анализът не произвежда неспецифични продукти на амплификация, като по този начин се конкурира с PCR реагентите или инхибира основната реакция на амплификация.

Разбира се, в някои случаи специфичността не е най-важната, например, когато целта е количествено определяне на тясно свързани, но различни патогени, се изисква специален дизайн, стандарти за оптимизация и проверка.

Кривата на топене е стандартен метод за оценка на специфичността на ампликоните, поне по отношение на това дали да се усили една единствена цел.Въпреки това, трябва да се подчертае, че кривите на топене могат да бъдат подвеждащи, защото, например, те могат да бъдат повлияни от комбинираните ефекти на неоптимални праймери и ниски концентрации на шаблона.

P5 |Кривата на топене показва Tm отместванията, получени от две детекции на различни количества от две целеви ДНК.

A. При по-високи концентрации (ad)), няма очевиден димер на праймера след приключване на qPCR измерването.Тъй като концентрацията на шаблона намалява до 50 копия (e), започва да се появява неспецифичен продукт и става единственият продукт с най-ниска концентрация (f).

B. Тестът регистрира една и съща Tms при всички целеви концентрации и няма очевиден димер на праймера дори при най-ниската концентрация (5 копия).При използване на тези два метода за откриване не са открити продукти на амплификация в NTC.

P5 показва кривите на разтваряне, получени с проби, в които матрицата присъства в различни концентрации.P 5a показва, че при двете най-ниски концентрации Tms на произведените неспецифични продукти на амплификация са по-ниски от тези на специфичните ампликони.

Очевидно този метод за откриване не може да се използва надеждно за откриване на цели, които съществуват в ниски концентрации.

Интересното е, че NTC, т.е. проби без никаква ДНК, не записват (неспецифични) продукти на амплификация, което показва, че фоновата геномна ДНК може да участва в неспецифична амплификация/полимеризация.

Понякога такива фонови праймери и неспецифично усилване не могат да бъдат поправени, но често е възможно да се проектира метод за откриване, който няма неспецифично усилване във всяка шаблонна концентрация и NTC (P 5b).

Тук дори записването на усилването на целевата концентрация с Cq от 35 ще доведе до специфична крива на разтваряне.По същия начин, NTCs не показват признаци на неспецифично усилване.Понякога поведението при откриване може да зависи от матерната луга и в определени буферни състави се открива само неспецифично усилване, което може да е свързано с различни концентрации на Mg2+.

Стабилност на откриване

Оптимизирането на Ta е полезна стъпка в процеса на емпирична проверка и оптимизация на qPCR откриване.Той осигурява директна индикация за устойчивостта на комплекта праймери, като показва температурата (или температурния диапазон), която произвежда най-ниския Cq, без да усилва NTC.

Двукратната до четирикратната разлика в чувствителността може да не е важна за хора с висока експресия на иРНК, но за диагностичните тестове може да означава разликата между положителни и фалшиво отрицателни резултати.

Та свойствата на qPCR праймерите могат да варират значително.Някои тестове не са много стабилни и ако не се извършат при оптималната стойност на Ta на праймерите, те бързо ще се сринат.

Това е важно, защото този тип откриване често е проблематично в реалния свят и чистотата на пробата, концентрацията на ДНК или наличието на друга ДНК може да не са оптимални.

В допълнение, целевият брой копия може да варира в широки граници и реактивите, пластмасовите прибори или инструменти може да са различни от тези, използвани при настройката на теста.

P6|Температурният градиент показва различната устойчивост на PCR откриването.

A. Използвайте Mastermix Sensifast SYBR на Bioline (каталожен номер BIO-98050), за да извършите PCR върху cDNA, приготвена от РНК на човешки мозък.

B. Използвайте инструмента CFX qPCR на Bio-Rad, за да запишете картата на амплификация и кривата на разтваряне на апален (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. Графика на усилване и крива на топене на ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. Графика на амплификация и крива на разтваряне на GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs, записан при различни температури на отгряване, показващ разликата в Cq, записан при температурен градиент от 7°C.

P 6 показва типичен резултат от нежелан тест, където qPCR е извършен с помощта на градиент Tas между 59C и 67C (P 6a), използвайки праймери за три специфични за човешкия мозък гена.

Може да се види от графиката на амплификацията, че праймерите Opalin далеч не са идеални, тъй като техният оптимален Ta обхват е много тесен (Фигура 6b), тоест Cqs са широко разпръснати, което води до значително сравнение на Cqs с тяхното оптимално Cqs Low.

Този метод на откриване е нестабилен и може да доведе до неоптимално усилване.Следователно тази двойка праймери трябва да бъде преработена.В допълнение, анализът на кривата на топене (вмъкване) показва, че спецификата на този метод за откриване също може да бъде проблематична, тъй като кривата на топене на всеки Ta е различна.

Методът за откриване ACSBG1, показан в P 6c, е по-стабилен от метода за откриване на Opalin по-горе, но все още е далеч от идеалния и е вероятно да бъде подобрен.

Ние обаче подчертаваме, че няма необходима връзка между устойчивостта и специфичността, тъй като кривата на разтваряне, получена от този метод за откриване, показва една и съща пикова стойност във всички Tas (вмъкване).

От друга страна, тестът за устойчивост е много по-толерантен, като произвежда подобни Cq в широк диапазон от Tas, както в теста GFAP, показан в P 6d.

Разликата в Cqs, получена в същия диапазон от 8 градуса по Целзий, е по-малка от 1, а кривата на разтваряне (вмъкване) потвърждава характеристиките на откриване в този температурен диапазон.Струва си да се отбележи, че изчисленият Tas и действителният диапазон на Ta може да са много различни.

Има много насоки, предназначени да помогнат на изследователите да проектират ефективни праймери, повечето от които се основават на отдавна установени правила и много внимание е обърнато на 3′-края на праймерите.Често се препоръчва да включите G или C в 3' края и две G или C основи (GC скоба), но не повече от две от последните 5 бази.

На практика тези правила могат да ръководят изследователите, но те не са непременно правилни при всички обстоятелства.

P7 |3′-краят на праймера има малък ефект върху специфичността или ефективността.

A. Позицията на праймерите за човешкия HIF-1α (NM_181054.2) ген.

B. Използвайте матерна луга Agilent Brilliant III SYBR Green (Кат. № 600882) за амплифициране на шест тестови елемента.

C. Графика на амплификация и крива на топене, записани от CFX qPCR инструмента на Bio-Rad и 3'крайни праймери.NTC са показани в червено.

D. Cqs запис на всеки тестов елемент

Например резултатът в P 7 противоречи на правилото за 3'край.Всички дизайни дават основно едни и същи резултати, като само две комбинации от праймери водят до неспецифично усилване в NTC.

Не можем обаче да подкрепим ефекта на GC клипа, защото в този случай използването на A или T като максимум 30 бази не намалява специфичността.

Тест C, където F праймерът завършва на GGCC, записва Cqs в NTC, което показва, че може да искате да избегнете тези последователности в 30-ия край.Подчертаваме, че единственият начин да се определи най-добрата 3′-крайна последователност на двойка праймери е да се оценят експериментално някои кандидат праймери.

Ефективност на усилване

Важно е, че въпреки че неспецифичното откриване на PCR никога не може да стане специфично, ефективността на амплификацията може да бъде регулирана и увеличена максимално по много различни начини чрез промяна на ензима, матерната течност, добавките и условията на циклиране.

За да се оцени ефективността на PCR откриването, най-добре е да се използва серийно разреждане на 10 или 5 пъти целевата нуклеинова киселина, т.е. „методът на стандартната крива“.

Ако PCR ампликони или синтетични ДНК мишени се използват за генериране на стандартна крива, серийните разреждания на тези мишени трябва да се смесват с постоянно количество фонова ДНК (като геномна ДНК).

P8 |Крива на разреждане за оценка на ефективността на PCR.

A. Използвайте праймери за HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA и R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC и Mastermix на Agilent Brilliant III SYBR Green (каталожен номер 600882) за PCR и условия на кривата на топене.

B. 100 ng РНК се транскрибират обратно, разреждат се 2 пъти и серийно разредени сДНК проби се разреждат 5 пъти до 1 ng човешка геномна ДНК.Кривата на топене е показана във вмъкването.

C. RT реакцията, разреждането и серийното разреждане се повтарят за втората сДНК проба и резултатите са подобни.

P 8 показва две стандартни криви, като се използва един и същ метод за откриване на две различни кДНК проби, резултатът е същата ефективност, около 100%, и стойността на R2 също е подобна, тоест степента на съответствие между експерименталните данни и регресионната линия или степента на линейност на данните.

Двете стандартни криви са сравними, но не съвсем еднакви.Ако целта е да се определи точно количествено целта, трябва да се отбележи, че е неприемливо да се предостави изчисление на броя на копията, без да се обясни несигурността

P9 |Несигурност на измерването, свързана с количественото определяне с помощта на стандартна крива.

A. Използвайте праймери за GAPDH (NM_002046), за да извършите PCR и условията на кривата на топене.F: ACAGTTGCCATGTAGACC и R: TAACTGGTTGAGCACAGG и Mastermix Sensifast SYBR на Bioline (каталожен номер BIO-98050).

Б. Диаграма на амплификация, крива на топене и стандартна крива, записани с инструмента CFX qPCR на Bio-Rad.

C. Графика на стандартната крива и 95% доверителен интервал (CI).

D. Броят на копията и 95% доверителен интервал на трите стойности на Cq, получени от кривата на разреждане.

P 9 показва, че за оптимизиран тест присъщата променливост на единична стандартна крива е приблизително 2 пъти (95% доверителен интервал, минимум до максимум), което може да е най-малката променливост, която може да се очаква.

Свързан продукт:

Комплект Cell Direct RT qPCR

Mouse Tail Direct PCR комплект

Директен PCR комплект за животински тъкани