RT-qPCR е основният експеримент на молекулярната биология и всеки трябва да е запознат с него.Основно включва три стъпки: екстракция на РНК, обратна транскрипция в кДНК и флуоресцентна количествена PCR в реално време.Не помага, какво става?Вероятно има проблем сексперимент с обратна транскрипция!Въпреки че изглежда, че експериментът с обратна транскрипция трябва само да добави РНК, dNTP, праймери иобратна транскриптазакъм епруветката на центрофугата и разбъркайте добре, но в действителния процес на работа все още има много подробности, на които трябва да се обърне внимание.Нека научим за това!

Как да преценим качеството на РНК?
За да се получи кДНК, качеството на РНК е критично!Качеството на РНК може да бъде открито главно от два аспекта:
(1) Целостта на РНК:Целостта на РНК може да се провери чрез електрофореза в агарозен гел. Вземайки еукариотите като пример, пълната обща РНК има три ясни ивици, молекулните тегла от големи до малки са 28S, 18S и 5S, а 28S е два пъти по-ярка от 18S;ако могат да се видят три ленти, но типът на лентата е замъглен или Дифузия означава, че РНК е частично разградена.В този момент, моля, незабавно изпълнете реакцията на обратна транскрипция и увеличете съответно въвеждането на шаблона;ако може да се види само лента с малко молекулно тегло или никаква лента, РНК е напълно разградена и трябва да бъде повторно екстрахирана.Agilent 2100 показва целостта на РНК с пикова диаграма и RIN стойност.Ако нуклеиновата киселина е непокътната, базовата линия на електроферограмата е плоска;ако нуклеиновата киселина е силно разградена, базовата линия е неравномерна и се появяват повече пикове на разграждане;стойността на RIN отразява целостта на РНК, в диапазона от 0-10, колкото по-голяма е стойността, толкова по-добро е качеството на РНК.Е, толкова по-висока е степента на пълнота.
(2) Чистота на РНК:Съотношението на OD260/280 може да бъде открито чрез UV спектрофотометрия.Ако съотношението на OD260/280 е между 1,9 и 2,1, чистотата е много добра.
Остатъчната геномна ДНК може да доведе до неточни количествени резултати
Когато РНК се екстрахира, получената РНК може да бъде смесена с геномна ДНК (gDNA), която не е била почистена.Следователно cDNA след обратна транскрипция също ще бъде смесена сgDNA.По време на течениетоqPCRреакция,cDNAи gDNA могат да бъдат амплифицирани едновременно, което води до относително малка стойност на CT, така че резултатите може да са предубедени.
И така, какво трябва да направим в тази ситуация?Foregineпредлага:
(1) Извършете почистване на генома на обърнатата РНК, която може да бъде отстранена чрез колонна екстракция по време на екстракция на РНК;
(2) Третирайте извлечената РНК с ДНКазаI , но го прекратете с EDTA;
реагенти за обратна транскрипцияс модули за изчистване на генома;

Как да изберем праймери за обратна транскрипция?
Праймерите за обратна транскрипция също влияят върху резултата от реакцията на обратна транскрипция.Можете да изберете произволни праймери, Oligo dT или ген-специфични праймери за обратна транскрипция според конкретните обстоятелства на експеримента:
(1) Специфични преписи: препоръчват се ген-специфични праймери;
(2) Дълги преписи на фрагменти: Oligo dT/ген-специфични праймери се препоръчват;
(3) Вътрешни фрагменти от дългосегментни транскрипти: ген-специфични праймери/случайни праймери/случайни праймери + Oligo dT.Ако бъде извършен последващият qPCR експеримент, Oligo dT не може да се използва самостоятелно, тъй като използването само на Oligo dT може да причини отклонение в 3' края, което води до неточни резултати от qPCR експеримента;
(4) miRNA: Могат да се използват праймери за стеблови контури или праймери за опашка.

Колко пъти трябва да се разреди сДНК на продукта на обратната транскрипция за количествено определяне?
След получаване на сДНК на продукта на обратната транскрипция, колко пъти трябва да се разреди сДНК за qPCR експерименти е много важно.Ако концентрацията на кДНК е твърде висока или твърде ниска, ефективността на амплификацията може да бъде засегната.Може ли да се измери концентрацията на кДНК и как трябва да се направи?
(1) Концентрацията на cDNA на продукта на обратната транскрипция не може да бъде измерена, тъй като в допълнение към продукта на обратната транскрипция, продуктът на обратната транскрипция също съдържа остатъчен буфер за обратна транскрипция, обратна транскриптаза, праймери и т.н., които ще повлияят на резултатите от измерването на концентрацията и ще причинят ненормално съотношение OD260/280, OD260/230 и следователно не отразява истинския добив на cDNA.По това време някои приятели ще кажат, тогава ще измервам концентрацията след пречистване;тук Foregene би искал да напомни, че cDNA не се препоръчва да се пречиства, тъй като дължината на cDNA, получена чрез обръщане, е различна и късата cDNA ще бъде загубена при пречистването.
(2) Какво да правя?Преди qPCR експеримента градиентът на разреждане на cDNA може да бъде определен чрез предварителния експеримент.Например: използвайте изходен разтвор на cDNA, 10-кратно разреждане и 100-кратно разреждане като шаблони за qPCR експерименти и изберете фактора на разреждане с CT стойност в диапазона 18-28.

Как трябва да се транскрибират miRNA?
miRNA е едноверижна малка молекула РНК с размер около 22 nt, която не кодира протеин.Поради късата си дължина, конвенционалният qPCR метод е трудно да се определи директно количествено, така че често е необходимо да се разшири miRNA;често използваните методи за обратна транскрипция за miRNA включват метода на стволовата бримка и метода на опашката.
Методът на стволовата бримка е да се разшири miRNA чрез добавяне на праймери на стволовата бримка.Този метод на откриване има по-висока чувствителност и специфичност, но производителността на откриване е ниска.Една обратна транскрипция може да открие само една miRNA и вътрешна референция;методът за добавяне на опашка се състои от два. Завършва се от съвместното действие на два ензима, които са PolyA полимераза и обратна транскриптаза.PolyA полимеразата е отговорна за добавянето на PolyA опашки към miRNA, за да се увеличи нейната дължина, а обратната транскриптаза извършва реакция на обратна транскрипция.Този метод има висока производителност на откриване и може да открие множество miPHK и вътрешни препратки в една обратна транскрипция, но чувствителността и специфичността са ниски при метода на стволовата бримка.