PCR в реално време, известен също като количествена PCR или qPCR, е метод за наблюдение и анализ в реално време на продукти за PCR амплификация.
Тъй като количественият PCR има предимствата на проста работа, бърза и удобна, висока чувствителност, добра повторяемост и ниска степен на замърсяване, той се използва широко в медицински тестове, оценка на ефикасността на лекарствата, изследване на генната експресия, трансгенни изследвания, откриване на гени, откриване на патогени, откриване на животни и растения., тестване на храни и други области.
Следователно, независимо дали се занимавате с фундаментални изследвания в областта на науките за живота или сте служители на фармацевтични компании, животновъдни компании, хранителни компании или дори служители на входно-изходни инспекции и карантинни бюра, отдели за мониторинг на околната среда, болници и други звена, вие ще бъдете повече или по-малко изложени на Или трябва да знаете знанията за овладяване на количествения PCR.

Принцип на PCR в реално време

Real Time PCR е метод, при който флуоресцентни субстанции се добавят към PCR реакционната система и интензитетът на флуоресцентния сигнал в процеса на PCR реакция се наблюдава в реално време от количествен PCR инструмент и накрая експерименталните данни се анализират и обработват.

【Крива на усилване】е кривата, описваща динамичния процес на PCR.Кривата на амплификация на PCR всъщност не е стандартна експоненциална крива, а сигмоидна крива.

[Фаза на платформата на кривата на усилване]С увеличаването на броя на PCR циклите, инактивирането на ДНК полимеразата, изчерпването на dNTP и праймерите и инхибирането на реакцията на синтез от реакционния страничен продукт пирофосфат и т.н., PCR не винаги се разширява експоненциално., и в крайна сметка ще навлезе в плато.

[Област на експоненциален растеж на кривата на усилване]Въпреки че фазата на платото варира значително, в определен участък от областта на експоненциален растеж на кривата на амплификация, повторяемостта е много добра, което е много важно за количествения анализ на PCR.

[Прагова стойност и Ct стойност]Ние задаваме граничната стойност на откриване на флуоресценция в подходящата позиция в зоната на експоненциален растеж на кривата на усилване, а именно праговата стойност (Threshold).Пресечната точка на праговата стойност и кривата на усилване е стойността на Ct, т.е. стойността на Ct се отнася до броя на циклите (прагов цикъл), когато се достигне праговата стойност.

Графиката по-долу ясно показва връзката между праговата линия и кривата на усилване, прага и стойността на Ct.

【Как да се определи количествено?】

От математическата теория е доказано, че стойността на Ct има обратна линейна връзка с логаритъма на броя на първоначалните шаблони.PCR в реално време наблюдава продуктите на PCR амплификация в реално време и ги определя количествено по време на експоненциалната фаза на амплификация.

За всеки цикъл на PCR, ДНК се увеличава експоненциално 2 пъти и скоро достига плато.

Ако приемем, че количеството на изходната ДНК е A₀ , след n цикъла, теоретичното количество ДНК продукт може да се изрази като:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

След това, колкото по-голямо е първоначалното ДНК количество A 0, толкова по-скоро количеството на амплифицирания продукт достигне стойността на откриване An, а броят на циклите при достигане на An е стойността на Ct.Тоест, колкото по-голямо е първоначалното количество ДНК A 0, толкова по-рано достига пик на кривата на амплификация и съответно необходимият брой цикли n е по-малък.

Извършваме градиентно разреждане на стандарта с известна концентрация и го използваме като шаблон за PCR в реално време и ще бъдат получени поредица от амплификационни криви на равни интервали в реда на началното количество на ДНК от повече към по-малко.Според линейната връзка между стойността на Ct и логаритъма на броя на началните шаблони, a[стандартна крива] може да бъде създадена.

Чрез заместване на Ct стойността на пробата с неизвестна концентрация в стандартната крива може да се получи първоначалното количество на шаблона на пробата с неизвестна концентрация, което е количественият принцип на PCR в реално време.

Метод за откриване на PCR в реално време

PCR в реално време открива продуктите на PCR амплификация чрез откриване на интензитета на флуоресценция в реакционната система.

Принцип на метода за вграждане на флуоресцентно багрило】

Флуоресцентни багрила, като TB Green ® , могат неспецифично да се свържат с двойноверижна ДНК в PCR системи и да флуоресцират при свързване.

Интензитетът на флуоресценция в реакционната система нараства експоненциално с увеличаването на PCR циклите.Чрез откриване на интензитета на флуоресценция, количеството на амплификацията на ДНК в реакционната система може да се наблюдава в реално време и след това количеството на началния шаблон в пробата може да бъде обратно оценено.

【Принцип на метода на флуоресцентната сонда】

флуоресцентна сондае последователност на нуклеинова киселина с флуоресцентна група в 5' края и гасителна група в 3' края, която може специфично да се свърже към шаблона.Когато сондата е непокътната, флуоресценцията, излъчвана от флуорофора, се потушава от охлаждащата група и не може да флуоресцира.Когато сондата се разложи, флуоресцентното вещество ще се дисоциира и ще излъчва флуоресценция.

Флуоресцентна сонда се добавя към PCR реакционния разтвор.По време на процеса на отгряване флуоресцентната сонда ще се свърже към специфичната позиция на шаблона.По време на процеса на удължаване, 5'→3' екзонуклеазната активност на PCR ензима може да разложи флуоресцентната сонда, хибридизирана с шаблона, и флуоресцентната субстанция се дисоциира, за да излъчва флуоресценция.Чрез откриване на интензитета на флуоресценция на сондата в реакционната система може да се постигне целта за проследяване на количеството на амплифициране на PCR продукта.

【Избор на метод за откриване на флуоресценция】

Ако се използва за разграничаване на последователности с висока хомология и извършване на мултиплексна PCR детекция, като SNP типизиращ анализ, методът на флуоресцентната сонда е незаменим.
За други PCR експерименти в реално време може да се използва прост, лесен и евтин флуоресцентен химерен метод.

сонди Силна специфичност, способна на мултиплексна PCR

Недостатък

Високи специфични изисквания за усилване;

мултиплексна PCR не може да бъде извършена Необходимост от проектиране на специфични сонди, висока цена;

понякога дизайнът на сондата е труден

Свързани продукти: