В експериментите с qPCR дизайнът на праймера също е много важна връзка.Дали праймерите са подходящи или не е тясно свързано с това дали ефективността на амплификацията достига стандарта, дали амплифицираните продукти са специфични и дали експерименталните резултати са налични.
И така, как да направим по-добра специфичността на qPCR праймера?Висока ефективност на усилване?
Днес ще ви отведем да проектираме заедно qPCR праймери и ще позволим на проектирането на qPCR праймери да се превърне в ефикасно познавателно умение в експерименти.
Когато проектирате qPCR праймери, обикновено обръщайте внимание на следните точки: праймерите трябва да бъдат проектирани през интрони колкото е възможно повече, дължината на продукта трябва да бъде 100-300 bp, стойността на Tm трябва да бъде възможно най-близо до 60°C, а праймерите нагоре и надолу по веригата трябва да са възможно най-близо и краят на праймера трябва да бъде G или C и т.н. изчакайте.
1. Дизайн на праймери, обхващащи интрони
При проектирането на qPCR праймери, изборът на праймери, проектирани през интрони, може да предотврати амплифицирането на gDNA матрицата и всички продукти са получени от амплификацията на cDNA, като по този начин се елиминира влиянието на gDNA замърсяване.
2. Дължина на грунда
Дължината на праймера обикновено е между 18-30 nt, а дължината на амплификационния продукт трябва да се контролира между 100-300 bp, доколкото е възможно.
Ако праймерът е твърде къс, това ще доведе до неспецифична амплификация, а ако е твърде дълъг, лесно ще образува вторична структура (като структура на фиби).Ако продуктът на амплификация е твърде дълъг, той не е подходящ за реакцията на полимераза, което ще повлияе на ефективността на PCR амплификацията.
3. GC съдържание и Tm стойност
Съдържанието на GC в праймерите трябва да се контролира между 40% и 60%.Ако е твърде висока или твърде ниска, това не е благоприятно за започване на реакцията.Съдържанието на GC в предните и обратните праймери трябва да бъде близко до същото, за да се получи същата стойност на Tm и температура на отгряване.
Стойността на Tm трябва да бъде между 55-65°C, доколкото е възможно, обикновено около 60°C, а стойността на Tm нагоре и надолу по веригата трябва да бъде възможно най-близка, за предпочитане не повече от 4°C.
4. Избягвайте да избирате A в 3' края на праймера
Когато 3' краят на праймера не съответства, има големи разлики в ефективността на синтеза на различните бази.Когато последната база е А, тя също може да инициира верижен синтез дори в случай на несъответствие, а когато последната база е Т Когато , ефективността на индукцията на несъответствие е значително намалена.Затова се опитайте да избегнете избора на A в 3' края на праймера и е по-добре да изберете T.
Ако това е праймер на сонда, 5'-краят на сондата не може да бъде G, тъй като дори когато една G база е свързана към FAM флуоресцентната репортерна група, G може също да потуши флуоресцентния сигнал, излъчван от FAM групата, което води до фалшиво отрицателни резултати.Се появи.
5. Базово разпределение
Разпределението на четирите бази в праймера за предпочитане е произволно, като се избягват повече от 3 последователни G или C в 3' края и повече от 3 последователниG или C са лесни за генериране на сдвояване в богатата на GC област на последователност.
6. Областта на проектиране на грунд трябва да избягва сложни вторични структури.
Вторичната структура, образувана от единичната верига на амплификационния продукт, ще повлияе на гладкото протичане на PCR.Като прогнозирате предварително дали има вторична структура в целевата последователност, опитайте се да избегнете този регион при проектирането на праймери.
7. Самите праймери и между праймерите трябва да се опитват да избягват последователни допълващи се бази.
Не може да има последователна 4 базова комплементарност между самия праймер и праймера.Самият праймер не трябва да има допълнителна последователност, в противен случай той ще се сгъне, за да образува структура на фиби, което ще повлияе на комбинацията от отгряване на праймера и шаблона.
Не могат да съществуват комплементарни последователности между праймерите нагоре и надолу по веригата.Допълването между праймерите ще произведе димери на праймера, което ще намали ефективността на PCR и дори ще повлияе на количествената точност.Ако структурите праймер-димер и фиби са неизбежни, стойността на △G не трябва да е твърде висока (трябва да бъде под 4,5 kcal/mol).
8. Праймерите усилват целевия специфичен продукт.
Крайната цел на откриването на qPCR е да се разбере изобилието на целевия ген.Ако възникне неспецифично усилване, количественото определяне ще бъде неточно.Следователно, след като праймерите са проектирани, те трябва да бъдат тествани от BLAST и специфичността на продуктите се сравнява в базата данни с последователности.
След това вземаме човешкия GAS6 (специфичен за спиране на растежа 6) ген като пример за проектиране на qPCR праймери.
01 заявка ген
Хомо ГАЗ6чрез NCBI.Тук трябва да обърнем внимание на сравняването на името на гена и вида, за да сме сигурни, че са последователни.
02 Намерете генната последователност
(1) Ако целевата последователност е геномна ДНК, изберете първата, която е геномната ДНК последователност на гена.
(2) Ако целевата последователност е иРНК, изберете втората.След като въведете, щракнете върху „CDS“ в таблицата по-долу.Кафявата фонова последователност е кодиращата последователност на гена.
03 Грундове за дизайн
Влезте в интерфейса Primer-BLAST
Въведете последователния номер на гена или последователността във формат Fasta в горния ляв ъгъл и попълнете съответните параметри.

Щракнете върху „Получаване на праймери“ и NCBI ще изскочи, за да ви каже, че такъв избор на параметри ще бъде разширен към други варианти на снаждане.Можем да проверим различните варианти на снаждане и да ги изпратим, за да получим подходящата двойка праймери (както е показано на фигурата по-долу).Изпълнението на този процес може да отнеме десетки секунди.
Температурите на отгряване на тези двойки праймери са около 60°C.Според целта на експеримента изберете праймери с умерена дължина, добра специфичност и по-малко самодопълване на праймерите за експеримента, а процентът на успех е доста висок!
04 Проверка на специфичността на праймера
Всъщност, в допълнение към проектирането на грундове, Primer-Blast може също така да оцени грундовете, които сами проектирахме.Върнете се на страницата за проектиране на праймера, въведете предназначените от нас праймери нагоре и надолу по веригата и други параметри няма да бъдат коригирани.След като изпратите, можете да видите дали двойката праймери съществува и върху други гени.Ако всички те са показани на гена, който искаме да амплифицираме, което показва, че специфичността на тази двойка праймери е страхотна!(Например, това е единственият резултат от заявката за праймер!)

05 Оценка на качеството на грунд
Какъв вид праймер е „перфектният“ праймер, който съчетава „ефективност на усилване до стандарта“, „усилени характеристики на продукта“ и „надеждни експериментални резултати“?
Ефективност на усилване

крива на топене
Ефективността на амплификацията на праймерите достига 90%-110%, което означава, че ефективността на амплификация е добра и кривата на топене има един пик и обикновено Tm>80°C, което означава, че специфичността на амплификация е добра.
 
Свързани продукти:
PCR в реално време Easy–SYBR GREEN I
PCR в реално време Easy-Taqman