РНКаза е чувствителна дума, която много студенти, които често провеждат експерименти за екстракция на РНК, не искат да чуят.Напълно въоръжена, РНК, която накрая беше извлечена със силно токсичните реагенти фенол и хлороформ, беше разградена.Не се примирявам!!!Днес нека да разгледаме произхода на известната Rnase.

Рибонуклеазата (RNase) или RNase е нуклеаза, която може да хидролизира РНК в малки молекули.РНКазата, като протеин с малка молекула, е необичайно стабилна .Конвенционалната стерилизация с пара при висока температура и високо налягане и протеиновите инхибитори не могат напълно да я деактивират.Стабилността на РНКазата идва главно от дисулфидните връзки в структурата.Например, често използваната РНКаза на говежди панкреас има само 124 аминокиселини, но съдържа 4 дисулфидни връзки.Сярната връзка и дисулфидната връзка придават на РНКазата отлична термична стабилност.В допълнение, rnase има относително малко молекулно тегло и може бързо да възстанови първоначалната си конформация в много случаи.

Освен че е изключително стабилен,РНКазите са повсеместно разпространени в лабораторията .РНКазата е биологичен защитен механизъм.За една клетка екзогенната РНК често е фатална.В сравнение с екзогенната ДНК, екзогенната РНК често е по-опасна.РНК се транскрибира и транслира успешно, така че почти всички организми са развили РНКази, за да се защитят от нахлуването на екзогенна РНК.Следователно бактериалните клетки, култивирани в лабораторията, и вие, които извличате РНК, излъчват аромата на РНКаза.Течностите на човешкото тяло (слюнка, сълзи и т.н.) съдържат голямо количество РНКаза, така че не плачете, когато РНК се разгражда.Колкото повече плачете, толкова по-лошо е разграждането на РНК!!Сестра Даю не е подходяща за екстракция на РНК!

В допълнение, вашата деликатна кожа също съдържа много РНКаза, а маркерите, пипетите, вратите на хладилника и дръжките на вратите, които са били докоснати от кожата, също съдържат РНКаза.

С толкова много блуждаене, нека да разгледаме как да се справим с RNases.

Първото нещо, за което всеки си мисли, когато премахва РНК, еDEPC(диетил пирокарбонат).DEPC основно денатурира протеина чрез комбиниране с имидазоловия пръстен на активната група на РНКаза хистидин, като по този начин инхибира активността на ензима.0,1% DEPC може да има по-добър ефект на премахване на Rnase, но трябва да обърнем внимание, че DEPC е известен канцероген, така че трябва да се обърне специално внимание, когато се използва.

За РНКаза трябва да започнем от два аспекта,първият е да инхибира активността на ендогенната РНКаза

Конвенционалните реагенти за екстракция на РНК като гуанидин изотиоцианат и DTT, съдържащи се в Тризол, могат да отворят дисулфидната връзка на РНКазата, но все още има някои РНКази, особено в тъканни проби, така че обърнете внимание на ниската температура.

1.Незабавно потопете тъканната проба в течен азот, след като я извадите, или в търговски разтвор за запазване на РНК.

2.След като извлечете РНК от клетъчната проба, добавете я към лизиращия разтвор и я лизирайте върху кутията за лед

3. Най-добре е да използвате течен азот за смилане когато тъканните проби се хомогенизират.Когато използвате електрически хомогенизатор без течен азот, обърнете внимание на пълното предварително охлаждане на адаптера за хомогенат.

Втората е екзогенна ДНКаза

1.Бъдете напълно въоръжени, носете лабораторна престилка, носете маска и не забравяйте да носите чифт нови ръкавици (не бъдете толкова пестеливи!! Трябва да се отбележи, че Trizol е супер корозивен и също така е много силен през ръкавици, така че не капете върху ръцете си).

2.Всички използвани накрайници за пипети, EP епруветки, PCR епруветки и друго оборудване трябва да бъдат третирани с де-RNase.Може да се накисне в 0,1% DEPC и след това да се постави под високо налягане.Обърнете внимание на работата в абсорбатор.Местните тирани могат директно да купуват консумативи за премахване на ензими.

PS: Нека ви кажа един мързелив метод.Въпреки че високата температура и високото налягане не могат напълно да премахнат РНКазата, те ще премахнат голяма част от нея.2 пъти висока температура и високо налягане има добър ефект, а извличането на РНК има малък ефект.

3.Алкохолът може да денатурира протеини,така че масата за екстракция на РНК може да се избърше със 75% алкохол , а ръкавиците също могат да се напръскат със спирт.

4.Крайният разтвор за разтваряне на РНК и центрофужната епруветка също трябва да бъдат третирани с де-РНКаза.DEPC водата е често използван разтвор за разтваряне на РНК.Нека поговорим за правилния метод за приготвяне на DEPC вода (не забравяйте да преопаковате търговската DEPC, когато я купувате)

Добавете DEPC към ултрачиста вода при 1:1000, разклатете добре, оставете да престои една нощ при 37°C и стерилизирайте при 121°C при висока температура и високо налягане за 15 минути.DEPC вода може да се съхранява при -20°C в аликвотни части от 1 ml.

И накрая, да обобщим: ниската температура е ключът, консумативите се обработват добре, напълно въоръжени и по-малко приказки!

Е, това е всичко за днешната стратегия.Пожелавам ви концентрацията и чистотата на РНК, които споменахте.И двете А260/А280 са 2.0!!!

Разбира се, ако използвате aработа при стайна температура Комплект за екстракция на РНК, може да не срещнете горните проблеми.

Работа при стайна температура, без добавяне на ДНКаза, извлича общата РНК от клетките за 11 минути и извлича общата РНК от животински тъкани или растения за 30 минути.

За пробни проби, моля свържете се с:overseas@foregene.com

Свързани продукти:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/