Традиционните обратни транскриптази не могат да понасят високи температури (оптималната температура за активност на MMLV е 37-50°C, а AMV е 42-60°C).По-сложната вирусна РНК не може да бъде ефективно обратно транскрибирана в сДНК при ниски температури, което води до намаляване на ефективността на откриване.Традиционният RT-qPCR обикновено изисква участието на два ключови ензима (обратна транскриптаза и ДНК полимераза), което прави невъзможно опростяването на работата на реакционната система и намаляването на разходите.Тук ще представим две устойчиви на висока температура обратни транскриптази, TtH и RevTaq.Тези два ензима също имат функцията на ДНК полимераза, така че се наричат ​​бифункционални ензими.

TtH ДНК полимераза

Сигурно сте чували за TtH, който се извлича от термофилната бактерия Thermus thermophilus HB8.В присъствието на двувалентни катиони като Mg2+, той има ДНК полимеразна активност.Той се използва широко в PCR реакции като Taq ензима, но има по-висока устойчивост на топлина от Taq ензима, така че има и по-добър ефект върху PCR с шаблони с високо съдържание на GC.

· Този ензим основно няма 3'→5' екзонуклеазна активност и 5'→3' екзонуклеазна активност, така че може да се използва и за дидезокси секвениране.

· Този ензим има RTase активност.В присъствието на Mn2+ активността на RTase ще бъде повишена.С помощта на тази функция може да се използва за извършване на реакция на обратна транскрипция и PCR реакция в една и съща епруветка, тоест едноетапна RT-PCR.Въпреки това, в присъствието на Mn2+, точността на RT-PCR не е висока.RT активността няма нищо общо с активността на rnaase H.

· Повишената активност на Tth-ДНК полимеразата (pH9, оптимално +55℃～+70℃, максимум +95℃) преодолява проблемите, причинени от вторичната структура на РНК.Получената сДНК може да бъде амплифицирана чрез PCR със същия ензим в присъствието на Mg2+ йони.

· Способността на Tth-ДНК полимеразата да извършва обратна транскрипция и ДНК амплификация при високи температури прави този ензим полезен за количествена RT-PCR, клониране и анализ на генната експресия на клетъчна и вирусна РНК.
· Tth-ДНК полимераза се използва за RT-PCR за амплифициране на РНК до 1kb.

Характеристики и предимства

Tth ДНК полимераза:

• Осигурете оптимизиран размер на продукта на полимеразна верижна реакция (PCR), поне 1000 bp в RT-PCR реакцията

• Приемете модифициран дезоксирибонуклеозид трифосфат като субстрат

• Не е свързано с активността на RNase H

• Има висока термична стабилност за преодоляване на проблеми, обикновено свързани с високата вторична структура, присъстваща в РНК

RevTaq RT-PCR ДНК полимераза

Топлоустойчива ДНК полимераза с обратна транскриптазна активност

RevTaq-RT-PCR-ДНК полимераза е конструиран, силно устойчив на топлина, двойно функционален ензим с обратна транскриптаза и ДНК полимеразна активност, получени чрез насочена и изкуствена еволюция.

· Полуживотът на RevTaq RT-PCR ДНК полимераза при 95°C е по-голям от 40 минути.

· RevTaq RT-PCR ДНК полимераза позволява високотемпературна обратна транскрипция директно от РНК шаблона и стъпката на обратната транскрипция може да се повтори многократно, за да се генерират повече cDNA шаблони.

· RevTaq RT-PCR ДНК полимераза позволява „нулева стъпка“ RT-PCR (без стъпка на изотермична обратна транскрипция), тъй като в стъпката на циклично PCR удължаване, обратната транскрипция и ДНК амплификацията се случват едновременно.Това също насърчава реакцията на обратна транскрипция при високи температури, като по този начин минимизира проблемите, възникнали при топенето на силната вторична структура в РНК при високи температури.

· Благодарение на базираната на аптамер формула за горещ старт, RevTaq RT-PCR ДНК полимераза ще даде по-добри резултати, когато температурата на отгряване и удължаване е по-висока от 57°C.

· Тъй като ензимът е устойчив на топлина, се препоръчва да се проектират праймери и сонди с много високи точки на топене (>60°C).

· Препоръчва се да се оптимизира температурата на етапа на отгряване/удължаване чрез температурен градиент по време на процеса на настройка на реакцията.

· Колкото по-висока е температурата, толкова по-висока е специфичността на PCR.Цикълът на обратна транскрипция обикновено се извършва при по-висока температура от PCR цикъла, тъй като ДНК праймер:РНК шаблонна хибридизация обикновено има по-висока точка на топене от ДНК праймер:сДНК шаблонен дуплекс.

· RevTaq RT-PCR ДНК полимераза е генетично проектирана и оптимизирана, а размерът на ампликона е между 60-300 bp.

Границата на откриване на ДНК полимераза RevTaq RT-PCR достига 4 копия/

Оптимизираната реакционна система (създаване на праймери с висока точка на топене) е показана на фигурата.RevTaq RT-PCR RT-PCR, управляван от ДНК полимераза, показва по-добра чувствителност от TaqPath 1-step RT-qPCR master mix и по-нисък градиент на разреждане на пробата за откриване.

Още предимства:

Функция за бърз старт → Първоначалната стъпка на термична денатурация може да бъде пропусната.

Аптамерна формула с горещ старт → Осигурява незабавно 100% ензимна активност и предотвратява неспецифично усилване при ниски температури (<57°C).

Функция на разцепване → Етапът на екстракция на РНК е пропуснат, тъй като RevTaq RT-PCR ДНК полимеразата може също да обработва сурови реакционни проби.Той може незабавно да унищожи клетъчните мембрани на еукариоти, бактерии и вируси в горещ RT-PCR цикъл.

IVD ниво на суровини → високи стандарти за качество и изключително конкурентни цени