Съвети за подобряване на възстановяването на лепилото

1. Увеличете натоварването на пробата по време на електрофореза.

2. Използвайте прясно приготвен буфер за електрофореза.

3. Когато режете лепило, опитайте се да режете само лепилото с ленти, за да намалите обема на рязане на лепило: не се нуждаете от лепило с малко целеви фрагменти, в противен случай това ще повлияе на степента на възстановяване.

4. След като разтопите две или повече парчета лепило, използвайте епруветка, независимо колко голям е обемът, и я прехвърлете в същата колона.

5. Разтворът, добавен в зола, може да бъде малко повече, което е по-благоприятно за свързването на ДНК към мембраната, но обикновено не надвишава 750 ul.

6. Ключът към възстановяването на гела е да се свърже ДНК с колоната чрез концентрацията на солта, киселинността (заряда) и хидрофобността на разтвора в колоната.Следователно, ако pH на буфера за електрофореза е твърде високо, 10 ul (pH 5,0, 3 mol/L NaAC) могат да се добавят към зола;за по-добро прихващане на ДНК молекулите върху мембраната, може да се добави 30% изопропанол за нагряване в течността след разтваряне на лепилото.

7. Преди да добавите елуента, оставете колоната на стайна температура за няколко минути (около 10 минути), за да се изпари напълно етанолът.

8. Накрая добавете по-малко елуент, за да сведете до минимум обема за възстановяване.Обикновено се използват 30-50 μl елуент за елуиране (не твърде малко, в противен случай няма да може да намокри мембраната, което не е благоприятно за елуиране);елуиращите капчици са в центъра на мембраната, за да се елуира напълно ДНК, свързана с мембраната.

9. След добавяне на елуента, той може да се елуира във водна баня от 55 градуса за 5 минути или да се постави във водна баня от 50 градуса за повече от 10 минути, или да се затвори с парафилм при 4 градуса за една нощ и след това да се центрофугира за възстановяване на следващия ден, ефектът е добър.

10. Добавете центрофугирания елуат обратно към адсорбционната колона и центрофугирайте отново.

Подробни методи и процедури за възстановяване на PCR продукт

1. Рециклиране на обикновен каучук

Ако искате да възстановите лепилото, най-добре е да използвате комплект, който е удобен и има малко по-висок процент на възстановяване.Ако наистина трябва да го възстановите ръчно, можете да добавите 3 пъти обема TE след изрязване на лепилото.След разтопяване на водна баня, фенолът, фенолът/хлороформът се екстрахират чисто и етанолът се утаява.Това е.

2. Възстановяване на ДНК от гелове с ниска точка на топене

Пречистване на ДНК фрагменти Добавете TE (10 mmol/l Tris-HCl pH8.0, 0.1 mmol/l EDTA), равен на обема на гела, и поставете във водна баня при 65°C за 5 минути, за да разтворите напълно гела.

След като се доведе до стайна температура, се добавя равно количество фенол (наситен с ТЕ, ТЕ се запечатва в горния слой и долният слой фенол се отстранява) и сместа се смесва внимателно (не е необходимо смесване) и се центрофугира при 12 000 rpm за 3 минути.Повторете 1-2 пъти.

Вземете супернатантата, добавете 0,1 обем от 3 mol/L натриев ацетат (рН 5,2) и 2,5 пъти обем абсолютен етанол, за да извършите утаяване с етанол.Разтворете пречистената ДНК с подходящо количество ТЕ, измерете съдържанието и подгответе за употреба (може да се използва за анализ на структурата на целевия ген, подготовка на сондата и т.н.).

3. PCR възстановяване с добра специфичност на амплификация

Ако специфичността на PCR амплификацията е добра, това е просто просто пречистване и възстановяване на PCR продукта.Можете да добавите 50 ug/ml протеиназа К към PCR продукта, 37 градуса за 1 час, да екстрахирате веднъж с фенол/хлороформ, да екстрахирате веднъж с хлороформ и да добавите 0,1 обем от супернатанта.Натриевият ацетат се възстановява чрез утаяване с 2,5 обема абсолютен етанол.

Свързани продукти:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/