Наскоро открих нещо невероятно!Много напреднали експериментални професионалисти около него дори не знаят някои много елементарни експериментални познания.

Можете ли например да отговорите на следните въпроси?

Има ли разлика между OD260 и A260?Какво означава всеки?
OD е съкращението на оптична плътност (оптична плътност), A е съкращението на абсорбция (абсорбция), двете понятия всъщност са еднакви, „оптична плътност“ е „абсорбция“, но „оптична плътност“ е в съответствие с повечето национални стандарти и е по-стандартизирана.

Обикновено измерваме стойността на OD при 260 nm, за да изчислим концентрацията на нуклеинова киселина, така че какво представлява 1OD?
Нуклеиновата киселина има максимален пик на абсорбция при дължина на вълната 260 nm, която съдържа както ДНК, така и РНК, както и фрагментирани фрагменти от нуклеинова киселина (това е ключовият момент).
Стойността на OD, измерена при дължина на вълната 260 nm, се записва като OD260.Ако пробата е чиста, стойността на OD260 може да изчисли концентрацията на пробата от нуклеинова киселина.
1 OD260=50 μg/ml dsDNA (двуверижна ДНК)
=37 μg/ml ssDNA (едноверижна ДНК)
=40 μg/ml РНК
=30 μg/ml dNTP (олигонуклеотиди)
Има ли някаква връзка и разлика между RT-PCR, Realtime-PCR и QPCR?
RT-PCR е съкращение от PCR с обратна транскрипция
PCR в реално време=qPCR, съкратено от Quantitative Real Time PCR
Въпреки че PCR в реално време (флуоресцентна количествена PCR в реално време) и PCR с обратна транскрипция (PCR с обратна транскрипция) и двете изглежда са съкратени като RT-PCR.Но международната конвенция е: RT-PCR конкретно се отнася до PCR с обратна транскрипция.

Какви са често използваните nt, bp и kb за описание на дължината на ДНК/РНК в биологията?
nt = нуклеотид
bp = базова двойка базова двойка
kb = килобаза

Разбира се, бихте казали, че много хора не се интересуват от тези малки подробности!Всички правят това и никой няма да ви попита какво е това.Знаете, че това е ненужно, нали?

Не, не, не, много е необходимо да знаете това!заради кое?
Защото искате да публикувате статия!Брат!Независимо дали се стремите към дипломиране или преследвате научни постижения, трябва да разчитате на статии, за да говорите!

Екстракцията на нуклеинова киселина трябва да бъде най-простият и основен експеримент.Качеството на екстракцията на нуклеинова киселина директно определя резултатите от последващите експерименти.

Въпреки че съм го казвал много пъти, все още има много приятели, на които не им пука.Този път реших да се махна от статията!

Минимална информация за публикуване на количествени PCR експерименти в реално време, наричани MIQE, е набор от насоки за количествени експерименти с флуоресценция, стартирани в международен план, които предлагат минимални стандарти за експерименталната информация, необходима за оценка на количествени PCR експерименти с флуоресценция и публикуване на статии.Чрез експерименталните условия и методите за анализ, предоставени от експериментатора, рецензентите могат по-добре да оценят валидността на експерименталната схема на изследователя.

Може да се види, че в раздела за екстракция на нуклеинова киселина са предложени следните елементи за откриване,

„E“ показва информация, която трябва да бъде предоставена, а „D“ показва информация, която трябва да бъде предоставена, ако е необходимо.

Формата е много сложна, всъщност искам да кажа, че всеки трябва да започне от това

чистота (D), добив (D), цялост (E) и консистенция (E) за оценка на нуклеиновите киселини в тези четири аспекта.

Според експерименталните навици първо говорете за методите за оценка на чистотата и концентрацията.

Измерването на OD е любимият и най-лесният метод за откриване за експериментаторите.Що се отнася до принципа, тук няма да навлизам в подробности.Много лаборатории сега използват ултра-микро спектрофотометри за директен количествен анализ на проби от нуклеинова киселина.Докато показва стойността на абсорбцията, програмата директно дава стойността на концентрацията (нуклеинова киселина, протеин и флуоресцентно багрило) и свързаните съотношения.Що се отнася до анализа на стойността на OD, запазете тази снимка и ще се оправите.

Списък с решения за универсална OD стойност

Има обаче няколко предупреждения, които трябва да бъдат изведени отделно за вас.

(В края на краищата знам, че вие ​​трябва да сте тези, които спестяват и чакат, докато ви потрябват!)

Бележка 1 Оборудване

Стойността на OD ще бъде повлияна от различно оборудване.Докато OD260 е в определен диапазон, стойностите на OD230 и OD280 са значими.Например диапазонът на абсорбция на обикновения Eppendorf D30 при 260 nm е 0~3 A, а NanoDrop One на Thermo е при 260 nm.Диапазон на абсорбция от 0,5 ~ 62,5 A.

Бележка 2Реагент за разреждане

Стойността на ОП може да бъде повлияна от разреждането на различни реагенти.Например, отчитането на OD260/280 на пречистена РНК в pH7,5 10mM Трисбуфер е между 1.9-2.1, докато внеутрален воден разтворсъотношението ще бъде по-ниско, може би само 1,8-2,0, но това не означава, че качеството на РНК се променя.

Бележка 3Остатъчни вещества

Наличието на остатъчни вещества ще повлияе на точността на измерване на концентрацията на нуклеинова киселина, така че е необходимо да се избягват протеинови, фенолни, полизахаридни и полифенолни остатъци в пробите от нуклеинови киселини, доколкото е възможно.

Всъщност обаче екстракцията с органични реактиви е стар метод.В търговските комплекти екстракционният ефект може да се постигне чрез адсорбционна колона на базата на силициев диоксид, комбинирана с центрофугиране, като се избягват токсични и вредни органични реагенти, които са трудни за отстраняване и т.н. Проблемът, като напр.Комплектът за екстракция на нуклеинова киселина на Foregene, не използва DNase/RNase и токсични органични реагенти по време на операцията, бързо и безопасно, и наефект едобре(случайно каза, че е плешив, но знам, че искате да знаете).

Пример 1: Добив и чистота при екстракция на геномна ДНК

Foregene Soil DNA Isolation Kit (DE-05511) третира почвени проби от различни източници и количеството и чистотата на получената геномна ДНК са показани в следната таблица:
Пример 2: Добив и чистота при екстракция на тъканна РНК

Animal Total RNA Isolation Kit (RE-03012) обработва различни тъканни проби и количеството и чистотата на получената РНК са показани в таблицата по-долу (за миши тъкани):
Въпреки това, не мислете, че сте приключили със стойността на OD.Имате ли някаква грижа за ключовите точки, които нарисувах за вас отпред?

Забележете

Фрагментираните молекули на нуклеинова киселина също ще бъдат изчислени в абсорбцията.Ако приемем, че имате геномни ДНК остатъци в РНК, вашата OD стойност ще изглежда много висока, но действителната концентрация на РНК не може да бъде определена.Дали вашата РНК е Не е ясно дали има разграждане, така че все още се нуждаем от цялостен метод за оценка, за да дадем по-точна преценка, тоест оценката на целостта на нуклеиновата киселина, спомената в MIQE.