一、Увеличете чувствителността на реакционната система:

1. Изолирайте висококачествена РНК:

Успешният синтез на кДНК идва от висококачествена РНК.Висококачествената РНК трябва поне да бъде с пълна дължина и да не съдържа инхибитори на обратната транскриптаза като EDTA или SDS.Качеството на РНК определя максималното количество информация за последователността, което можете да транскрибирате в кДНК.Общ метод за пречистване на РНК е едноетапен метод, използващ гуанидин изотиоцианат/киселинен фенол.За да се предотврати замърсяване от следи от РНКаза, РНК, изолирана от богати на РНКаза проби (като панкреас), трябва да се съхранява във формалдехид, за да се запази висококачествена РНК, особено за дългосрочно съхранение.РНК, извлечена от черен дроб на плъх, основно се разгражда след съхранение във вода в продължение на една седмица, докато РНК, извлечена от далак на плъх, остава стабилна след съхранение във вода в продължение на 3 години.В допълнение, транскриптите, по-дълги от 4 kb, са по-чувствителни към разграждане от следи от RNases, отколкото малките транскрипти.За да се увеличи стабилността на съхранените РНК проби, РНК може да се разтвори в дейонизиран формамид и да се съхранява при -70°C.Формамидът, използван за запазване на РНК, не трябва да съдържа остатъци, разграждащи РНК.РНК от панкреаса може да се съхранява във формамид поне една година.Когато се подготвяте да използвате РНК, можете да използвате следния метод за утаяване на РНК: добавете NaCl до 0,2 М и 4 пъти обема етанол, поставете на стайна температура за 3-5 минути и центрофугирайте при 10 000 × g за 5 минути.

2. Използвайте RNaseH-неактивната (RNaseH-) обратна транскриптаза:

Инхибиторите на RNase често се добавят към реакциите на обратна транскрипция, за да се увеличи дължината и добива на cDNA синтеза.Инхибиторите на RNase трябва да се добавят по време на реакцията на синтез на първата верига в присъствието на буфер и редуциращ агент (като DTT), тъй като процесът преди синтеза на cDNA денатурира инхибитора, като по този начин освобождава свързана RNase, която може да разгради RNA.Инхибиторите на протеиновата РНКаза предотвратяват само разграждането на РНК от РНКаза A, B, C и не предотвратяват РНКазата върху кожата, така че внимавайте да не въвеждате РНКаза от пръстите си, въпреки използването на тези инхибитори.

Обратната транскриптаза катализира превръщането на РНК в сДНК.Както M-MLV, така и AMV имат ендогенна RNaseH активност в допълнение към тяхната собствена полимеразна активност.Активността на RNaseH и активността на полимеразата се конкурират помежду си за хибридната верига, образувана между РНК шаблона и ДНК праймера или сДНК удължителната верига, и разграждат РНК веригата в комплекса РНК:ДНК.РНК матрицата, разградена от активността на RNaseH, вече не може да служи като ефективен субстрат за синтеза на сДНК, което намалява добива и продължителността на синтеза на сДНК.Следователно би било полезно да се елиминира или значително да се намали активността на RNaseH на обратната транскриптаза.。

SuperScript Ⅱ обратна транскриптаза, RNaseH-MMLV обратна транскриптаза и thermoScript обратна транскриптаза, RNaseH-AMV, могат да получат повече количество и повече сДНК с пълна дължина от MMLV и AMV.Чувствителността към RT-PCR ще бъде повлияна от количеството синтез на cDNA.ThermoScript е много по-чувствителен от AMV.Размерът на RT-PCR продуктите е ограничен от способността на обратната транскриптаза да синтезира кДНК, особено когато се клонират по-големи кДНК.В сравнение с MMLV, SuperScripⅡ значително увеличи добива на дълги RT-PCR продукти.RNaseH-обратната транскриптаза също има повишена термостабилност, така че реакцията може да се извърши при температури, по-високи от нормалните 37-42°C.При предложените условия на синтез използвайте олиго(dT) праймер и 10 μCi [α-P]dCTP.Общият добив на първата верига се изчислява с помощта на метода на утаяване на TCA.СДНК с пълна дължина се анализира с помощта на сортирани по размер ленти, изрязани и преброени върху алкален агарозен гел.

3. Повишете температурата на инкубация за обратна транскрипция:

По-високата температура на инкубация помага за отваряне на вторичната структура на РНК, увеличавайки добива на реакцията.За повечето РНК шаблони, инкубирането на РНК и праймерите при 65°C без буфер или сол, последвано от бързо охлаждане върху лед, ще елиминира повечето вторични структури и ще позволи на праймерите да се свържат.Въпреки това, някои шаблони все още имат вторични структури, дори след топлинна денатурация.Амплификацията на тези трудни шаблони може да се извърши с помощта на ThermoScript Reverse Transcriptase и поставяне на реакцията на обратна транскрипция при по-висока температура за подобряване на амплификацията.По-високите температури на инкубация също могат да повишат специфичността, особено когато се използват генно-специфични праймери (GSP) за синтез на cDNA (вижте Глава 3).Ако използвате GSP, уверете се, че Tm на праймерите е същата като очакваната температура на инкубация.Не използвайте олиго(dT) и произволни праймери над 60°C.Случайните праймери изискват инкубиране при 25°C за 10 минути преди повишаване на температурата до 60°C.В допълнение към използването на по-висока температура на обратна транскрипция, специфичността може също да бъде подобрена чрез директно прехвърляне на сместа РНК/праймер от температурата на денатурация 65°C към температурата на инкубация на обратната транскрипция и добавяне на предварително затоплена 2× реакционна смес (cDNA синтез с горещ старт) .Този подход помага да се предотврати междумолекулното сдвояване на основите, което се случва при по-ниски температури.Многократното превключване на температурата, необходимо за RT-PCR, може да бъде опростено чрез използване на термичен цикъл.

Tth термостабилна полимераза действа като ДНК полимераза в присъствието на Mg2+ и като РНК полимераза в присъствието на Mn2+.Може да се съхранява на топло при максимална температура от 65°C.Въпреки това, присъствието на Mn2+ по време на PCR намалява прецизността, което прави Tth полимеразата по-малко подходяща за високопрецизна амплификация, като клониране на cDNA.В допълнение, Tth има ниска ефективност на обратна транскрипция, което намалява чувствителността и, тъй като обратната транскрипция и PCR могат да бъдат извършени с един ензим, контролните реакции без обратна транскрипция не могат да се използват за сравняване на продукти на амплификация на cDNA със замърсяваща геномна ДНК.Продуктите от амплифицирането се разделят.

4. Добавки, които насърчават обратната транскрипция:

Добавки, включително глицерол и DMSO, се добавят към реакцията на синтез на първата верига, което може да намали стабилността на двойната верига на нуклеиновата киселина и да развърже вторичната структура на РНК.Могат да се добавят до 20% глицерол или 10% DMSO, без да се засяга активността на SuperScript II или MMLV.AMV може също така да понася до 20% глицерол без загуба на активност.За да се увеличи максимално чувствителността на RT-PCR в реакцията на обратна транскрипция SuperScriptⅡ, може да се добави 10% глицерол и да се инкубира при 45°C.Ако 1/10 от продукта на реакцията на обратна транскрипция се добави към PCR, тогава концентрацията на глицерол в реакцията на амплификация е 0,4%, което не е достатъчно, за да инхибира PCR.

5. RNaseH лечение:

Третирането на реакции на синтез на cDNA с RNaseH преди PCR може да повиши чувствителността.За някои шаблони се смята, че РНК в реакцията на синтез на сДНК предотвратява свързването на продуктите на амплификация, в който случай лечението с RNaseH може да повиши чувствителността.Като цяло, лечението с RNaseH е необходимо, когато се амплифицират по-дълги сДНК целеви шаблони с пълна дължина, като например туберозна шероза II с ниско копие.За този труден шаблон, лечението с RNaseH подобри сигнала, произведен от SuperScript II или AMV-синтезирана cDNA.За повечето RT-PCR реакции лечението с RNaseH не е задължително, тъй като стъпката на PCR денатурация при 95°C обикновено хидролизира РНК в комплекса РНК:ДНК.

6. Подобряване на метода за откриване на малка РНК:

RT-PCR е особено предизвикателство, когато са налични само малки количества РНК.Гликогенът, добавен като носител по време на изолирането на РНК, помага да се увеличи добивът на малки проби.Гликоген без РНКаза може да се добави едновременно с добавянето на Trizol.Гликогенът е водоразтворим и може да се поддържа във водната фаза с РНК, за да подпомогне последващото утаяване.За проби под 50 mg тъкан или 106 култивирани клетки препоръчителната концентрация на свободен от РНКаза гликоген е 250 μg/ml.

Добавянето на ацетилиран BSA към реакцията на обратна транскрипция с помощта на SuperScript II може да увеличи чувствителността, а за малки количества РНК, намаляването на количеството SuperScript II и добавянето на 40 единици нуклеазен инхибитор на RNaseOut може да повиши нивото на откриване.Ако в процеса на изолиране на РНК се използва гликоген, все още се препоръчва да се добави BSA или инхибитор на RNase, когато се използва SuperScript II за реакция на обратна транскрипция.

二、Увеличете специфичността на RT-PCR

1. CND Асинтез:

Синтезът на cDNA на първата верига може да бъде иницииран с помощта на три различни метода, чиято относителна специфичност засяга количеството и вида на синтезираната cDNA.

Методът на случаен праймер беше най-малко специфичният от трите метода.Праймерите се отгряват на множество места в целия транскрипт, генерирайки къси сДНК с частична дължина.Този метод често се използва за получаване на 5' крайни последователности и за получаване на сДНК от РНК шаблони с региони на вторична структура или с терминиращи места, които не могат да бъдат репликирани от обратна транскриптаза.За да се получи най-дългата сДНК, съотношението на праймерите към РНК във всяка РНК проба трябва да се определи емпирично.Началната концентрация на произволни праймери варира от 50 до 250 ng на 20 μl реакция.Тъй като сДНК, синтезирана от тотална РНК с помощта на случайни праймери, е предимно рибозомна РНК, поли(А)+РНК обикновено се избира като шаблон.

Олиго(dT) праймерите са по-специфични от произволните праймери.Той хибридизира с поли(А) опашката, намираща се в 3' края на повечето еукариотни иРНК.Тъй като поли(А)+ РНК е приблизително 1% до 2% от общата РНК, количеството и сложността на кДНК е много по-малко, отколкото при произволните праймери.Поради високата си специфичност, олиго(dT) обикновено не изисква оптимизиране на съотношението на РНК към праймери и поли(А)+ селекция.Препоръчва се използването на 0,5 μg олиго(dT) на 20 μl реакционна система.oligo(dT)12-18 е подходящ за повечето RT-PCR.Системата ThermoScript RT-PCR предлага олиго(dT)20 поради по-добрата си термична стабилност за по-високи температури на инкубация.

Генно специфичните праймери (GSP) са най-специфичните праймери за етапа на обратна транскрипция.GSP е антисензивен олигонуклеотид, който може специфично да хибридизира към целевата последователност на РНК, за разлика от произволните праймери или олиго(dT), които се свързват с всички РНК.Същите правила, използвани за проектиране на PCR праймери, се прилагат за дизайна на GSP в реакции на обратна транскрипция.GSP може да бъде същата последователност като амплификационния праймер, който се отгрява към най-3'-края на иРНК, или GSP може да бъде проектиран да се отгрява след праймера за обратно усилване.За някои амплифицирани субекти е необходимо да се проектира повече от един антисенс праймер за успешна RT-PCR, тъй като вторичната структура на таргетната РНК може да предотврати свързването на праймера.Препоръчва се да се използва 1 pmol антисенс GSP в 20 μl реакция на синтез на първа верига.

2. Повишете температурата на инкубация за обратна транскрипция:

За да се извлече пълното предимство на GSP специфичността, трябва да се използва обратна транскриптаза с по-висока термостабилност.Термостабилните обратни транскриптази могат да се инкубират при по-високи температури, за да се увеличи строгостта на реакцията.Например, ако GSP се отгрява при 55°C, специфичността на GSP няма да бъде напълно използвана, ако AMV или M-MLV се използват за обратна транскрипция при ниска строгост от 37°C.Въпреки това, SuperScript II и ThermoScript могат да реагират при 50°C или по-висока, което ще елиминира неспецифичните продукти, генерирани при по-ниски температури.За максимална специфичност сместа РНК/праймер може да се прехвърли директно от температурата на денатурация 65°C до температурата на инкубация на обратната транскрипция и да се добави към предварително затоплена 2× реакционна смес (горещ старт на cDNA синтез).Това помага за предотвратяване на сдвояване на междумолекулни бази при ниски температури.Множеството температурни преходи, необходими за RT-PCR, могат да бъдат опростени чрез използване на термичен цикъл.

3. Намалява замърсяването на геномната ДНК:

Потенциална трудност, срещана при RT-PCR, е замърсяването на геномна ДНК в РНК.Използването на добър метод за изолиране на РНК, като Trizol Reagent, ще намали количеството геномна ДНК, замърсяваща препарата на РНК.За да се избегнат продукти, получени от геномна ДНК, РНК може да се третира с ДНКаза I с степен на амплификация, за да се отстрани замърсяващата ДНК преди обратната транскрипция.Разграждането на DNase I се прекратява чрез инкубиране на пробите в 2.0 тМ EDTA за 10 минути при 65°С.EDTA може да хелатира магнезиевите йони, предотвратявайки зависимата от магнезиевите йони РНК хидролиза при високи температури.

За да се отдели амплифицираната сДНК от замърсяващите продукти за амплификация на геномна ДНК, могат да бъдат проектирани праймери, които всеки да се отгрява за отделяне на екзони.PCR продуктите, получени от cDNA, ще бъдат по-къси от тези, получени от замърсена геномна ДНК.В допълнение, контролен експеримент без обратна транскрипция беше извършен върху всяка РНК матрица, за да се определи дали даден фрагмент е получен от геномна ДНК или сДНК.PCR продуктът, получен без обратна транскрипция, се извлича от генома.