Като нов в лабораторията, не е добра работа да се отсяват положителни растения от куп растения с нисък процент на преобразуване.Първо трябва да се извлече ДНК от голям брой проби една по една и след това чуждите гени ще бъдат открити чрез PCR.Резултатите обаче често са празни и понякога са ленти с няколко елемента, но е невъзможно да се определи дали има пропуснати откривания или фалшиви откривания..Много ли е безпомощно да се изправиш срещу такъв експериментален процес и резултати?Не се тревожи, брат те учи как лесно и точно да отсяваш трансгенни положителни растения.

Етап 1

Праймери за откриване на дизайн

Определете ендогенния ген и екзогенния ген, които да бъдат открити според пробата, която ще се тества, и изберете представителна последователност от 100-500 bp в гена за проектиране на праймера.Добрите праймери могат да гарантират точността на резултатите от откриването и да съкратят времето за откриване (вижте приложението за често използвани праймери за откриване).

Забележка: Новоразработените праймери трябва да оптимизират условията на реакция и да проверят точността, прецизността и границата на откриване на откриването преди широкомащабно откриване.

Стъпка 2

Проектиране на експериментален протокол

Положителна контрола: Използвайте пречистената ДНК, съдържаща целевия фрагмент, като шаблон, за да определите дали PCR реакционната система и условията са нормални.

Отрицателна/празна контрола: Използвайте шаблона на ДНК или ddH2O, който не съдържа целевия фрагмент, като шаблон, за да откриете дали има източник на замърсяване в PCR системата.

Вътрешен референтен контрол: използвайте комбинацията праймер/сонда на ендогенния ген на пробата, която ще се тества, за да прецените дали шаблонът може да бъде открит чрез PCR.

Забележка:

За всеки тест трябва да се зададат положителни, отрицателни/празни контроли и вътрешни контроли, за да се оцени валидността на експерименталните резултати.

Подготовка на експеримента

Преди употреба проверете дали разтворът е смесен равномерно.Ако се установи утайка, тя трябва да се разтвори и разбърка според инструкциите преди употреба.2×PCR смес трябва да се пипетира и смеси многократно с микропипета преди употреба, за да се избегне неравномерно разпределение на йони.

Забележка:

Извадете ръководството и го прочетете внимателно и направете подготовка преди експеримента в строго съответствие с изискванията на ръководството.

Стъпка 4

Подгответе PCR реакционна система

Съгласно експерименталния протокол, смесете праймерите, H2O и 2 × PCR смесете равномерно, центрофугирайте и ги разпределете във всяка реакционна епруветка.

Забележка:

За широкомащабно или дългосрочно тестване се препоръчва използването на PCR реакционна система, съдържаща UNG ензим, който може ефективно да избегне аерозолно замърсяване, причинено от PCR продукти.

Стъпка 5

Добавете шаблон за реакция

Използвайки технологията Direct PCR, няма нужда от досаден процес на пречистване на нуклеинова киселина, шаблонът на пробата може да се подготви в рамките на 10 минути и може да се добави съответната PCR реакционна система.

Забележка:

Методът на разцепване има по-добър ефект на откриване и полученият продукт може да се използва за множество реакции на откриване.

5.1: Директно разширяване на листата

Според размера на картинката в ръководството, изрежете листната тъкан с диаметър 2-3 mm и я поставете в PCR реакционната система.

Забележка: Уверете се, че листните фрагменти са напълно потопени в PCR реакционния разтвор и не добавяйте прекалено много листна тъкан.

5.2: Метод на разделяне на листа

Нарежете листната тъкан с диаметър 5-7 mm и я поставете в центрофужна епруветка.Ако изберете зрели листа, моля, избягвайте да използвате тъканите на главната жилка на листа.Пипетирайте 50 ul буфер P1 лизат в центрофужна епруветка, за да се уверите, че лизатът може напълно да потопи листната тъкан, поставете го в термоциклер или метална баня и лизирайте при 95°C за 5-10 минути.

Добавете 50 ul буфер P2 неутрализиращ разтвор и разбъркайте добре.Полученият лизат може да се използва като шаблон и да се добави към PCR реакционната система.

Забележка: Количеството на матрицата е между 5-10% от PCR системата и не трябва да надвишава 20% (например, в 20 μl PCR система добавете 1-2 μl лизиращ разтвор, не повече от 4 μl).

Стъпка 6

PCR реакция

След центрофугиране на PCR реакционната епруветка, тя се поставя в PCR инструмент за амплификация.

Забележка:

Реакцията използва непречистена матрица за амплификация, така че броят на циклите на амплификация е с 5-10 повече цикъла, отколкото при използване на пречистена ДНК матрица.

Стъпка 7

Откриване на електрофореза и анализ на резултатите

M: 100bp ДНК стълба

1\4: Метод на пречистена ДНК

2\5: Директен PCR метод

3\6: Празна контрола

QC:

Резултатите от изпитването на различните контроли, зададени в експеримента, трябва да отговарят на следните условия.В противен случай трябва да се анализира причината за проблема и тестът да се извърши отново, след като проблемът бъде отстранен.

Таблица 1. Нормални резултати от тестове на различни контролни групи

*Когато плазмидът се използва като положителна контрола, резултатът от ендогенния генен тест може да бъде отрицателен

Преценка на резултата:

A. Резултатът от теста на ендогенния ген на пробата е отрицателен, което показва, че ДНК, подходяща за обикновена PCR детекция, не може да бъде извлечена от пробата или извлечената ДНК съдържа инхибитори на PCR реакцията и ДНК трябва да бъде извлечена отново.

B. Резултатът от теста на ендогенния ген на пробата е положителен, а резултатът от теста на екзогенния ген е отрицателен, което показва, че ДНК, подходяща за обикновено PCR откриване, е извлечена от пробата и може да се прецени, че XXX генът не е открит в пробата.

C. Резултатът от теста на ендогенния ген на пробата е положителен, а резултатът от теста на екзогенния ген е положителен, което показва, че ДНК, подходяща за обикновена PCR детекция, е извлечена от пробата и ДНК на пробата съдържа XXX гена.Експериментите за потвърждение могат да бъдат допълнително проведени.

Стъпка 8

Праймери за откриване на дизайн

След експеримента използвайте 2% разтвор на натриев хипохлорит и 70% разтвор на етанол, за да избършете експерименталната зона, за да предотвратите замърсяване на околната среда.