Всички говорят за принципа на qRT-PCR експеримента, дизайна на праймера, интерпретацията на резултатите и т.н., но мисля, че трябва да споделя с вас експерименталната работа на qRT-PCR.Малко е, но става въпрос за резултати.
Преди да направим qRT-PCR, трябва да имаме ясно разбиране за нашата собствена РНК и методите на работа.В крайна сметка нашите усилия са насочени към постигане на резултати, а не просто към практикуване.Така че, преди да направим qRT-PCR, трябва да определим следните проблеми (някои от които са приложими само за SYBR).
1 Сигурен ли си, че твоята РНК не е разградена?
NanoDrop 2000 може да открие само концентрацията и чистотата на РНК, но не може да открие целостта на РНК.
Стойността на RNA (RNA Intesity Number) може да отразява целостта на RNA, която се открива от системата Agilent 2100 Bioanalyzer.
Фиг. Схематична диаграма на стойностите на RIN за различни РНК проби (еукариоти)
Обаче лабораториите обикновено не разполагат с биоанализатор Agilent 2100.В този случай можем да открием чрез формалдехиден гел, но изискването за общо количество РНК е високо, така че най-бързият метод е да се използва обикновена гел електрофореза.Изисква се да бъде в среда без нуклеаза, така че е необходимо резервоарът за електрофореза, бутилката за зол, скобата за гел и гребена да се изплакнат с DEPC вода.Агарозата също е без нуклеаза (стига да е прясно отворена), а буферът за зареждане трябва да бъде прясно отворен, доколкото е възможно, с 1,2% гел.
Обърнете внимание, че гелът трябва да бъде напълно разтворен, в противен случай ще причини нехомогенни ивици, както е показано в проба 9 на фигурата.Ако напрежението е твърде високо или работи твърде дълго, това ще генерира топлина и ще причини разграждане на РНК, така че напрежението и времето трябва да се контролират разумно.В допълнение, пускането на гел може също допълнително да определи дали има ДНК остатък в пробата и да наблюдава дали има голям брой задържани ленти в разпределителната ямка.
Фигура.Откриване на РНК чрез гел електрофореза
2 Сигурни ли сте за концентрацията на вашата кДНК?
Опитът на големите братя в лабораторията е, че cDNA на системата от 20 ul, получена чрез всяка инверсия, се разрежда директно 20Х, докато постдокторантските сестри се разреждат 10Х.Обикновено завися от ситуацията.Тъй като качеството на РНК, споменато от всеки човек, е различно, нивото на обръщане също е различно и технологията на обръщане може да не е стабилна.
Така че всеки път, когато получа обърнатата кДНК, първо ще я разредя около 3 пъти и след това ще използвам домакинския ген, за да направя RT-PCR, броят на циклите обикновено е 25 цикъла, за да идентифицирам специфичната концентрация и след това да определя крайния фактор на разреждане.
3 Сигурни ли сте, че вашите грундове са лесни за използване?
Може да премине кривата на топене на qRT-PCR, но това все още струва пари.За лаборатории без много пари, когато получат много праймери, те могат да използват обикновена RT-PCR, за да видят дали е една лента и да идентифицират специфичността на праймерите.Ако лабораторията не изпитва недостиг на пари, специфичността на всички праймери може да бъде идентифицирана веднъж чрез кривата на топене.
4 Сигурни ли сте, че вашите експериментални условия са подходящи?
SYBR трябва да бъде защитен от силна светлина, така че опитайте да изключите горната светлина, когато добавяте реагент SYBR, и трябва да използвате само слаба светлина, за да го завършите.
Съхранявайте SYBR при 4°C.Когато се използва, внимателно обръщайте нагоре и надолу, за да смесите добре, за да избегнете образуването на пяна, и не разбърквайте енергично.
Някои по-малки сестри обичат да рисуват знаци върху PCR дъската от страх да не объркат пробите, което е погрешно.Тъй като е много вероятно вашите маркери да повлияят на събирането на флуоресцентни сигнали, обикновено препоръчвам на юношите да използват експериментални тетрадки за подпомагане на паметта, както е показано по-долу.
Фигура.Диаграма на зареждане на qRT-PCR проба
5 Сигурен ли си, че го правиш правилно?
Не забравяйте да носите ръкавици, носете ръкавици, носете ръкавици и кажете важни неща три пъти.
За да намаля излагането на SYBR на светлина, аз лично предпочитам първо да добавя шаблон, както е показано на фигурата по-долу.Според опита добавянето на малко количество шаблон е вероятно да причини грешки при вземане на проби.Следователно, за да минимизирам грешката, причинена от добавянето на малко количество шаблон, обикновено удвоявам пробата отново и удвоявам количеството, когато добавям пробата, за да намаля количеството добавен H2O2.
Фигура.Схематична диаграма на зареждане на qRT-PCR
След това конфигурирайте qRT-PCR системата, както следва.
Фигура.Схема за подготовка на qRT-PCR система
ЗАБЕЛЕЖКА: Процесът на конфигуриране трябва да се извърши на лед.
След като добавите пробата, залепете прозрачното запечатващо фолио.Опитайте се да не докосвате повърхността на прозрачното запечатващо фолио с ръцете си, просто действайте от пространството от двете страни на фолиото.Тъй като пръстовите отпечатъци също могат да повлияят на събирането на флуоресцентни сигнали.След това използвайте центрофуга за бързо центрофугиране за 10 секунди при ниска скорост, за да предотвратите увисването на пробата на стената.
Свързани продукти:
Време на публикуване: 28 април 2023 г
