COVID-19 е инфекциозно заболяване, причинено от Коронавирус тип 2 на тежък остър респираторен синдром. Когато човек е заразен, най-честите симптоми включват висока температура, кашлица и задух.

Пробите, използвани за изследване, могат да бъдат взети чрез назофарингеални тампони или орофарингеални тампони.

Какво е PCR?

Стандартният метод за откриване на коронавирус е полимеразна верижна реакция, PCR.Това е метод, който се използва широко в молекулярната биология.Той може бързо да копира милиони до милиарди специфични ДНК фрагменти.

Новият коронавирус съдържа много дълъг едноверижен РНК геном.За да се открият тези вируси чрез PCR, РНК молекулите трябва да бъдат превърнати в техните комплементарни ДНК последователности чрез обратна транскриптаза и след това новосинтезираната ДНК може да бъде амплифицирана чрез стандартни PCR процедури, които обикновено са известни като RT-PCR.

RT-PCR процес

Екстракция на РНК

За да се извърши този метод, вирусната РНК трябва основно да бъде извлечена.Могат да се използват различни комплекти за пречистване на РНК за удобно, бързо и ефективно разделяне.

За да извлечете вирусна РНК с помощта на търговски комплект, първо добавете пробата към микроцентрофужна епруветка и след това я смесете с лизисния буфер.Този буфер е силно денатуриран и обикновено се състои от фенол и гуанидин изотиоцианат.В допълнение, инхибиторите на РНКазата обикновено присъстват в лизисния буфер, за да осигурят изолиране на интактна вирусна РНК.

След добавяне на лизиращия буфер, завихрете епруветката за смесване чрез импулс и инкубирайте при стайна температура.След това вирусът се лизира при силно денатуриращи условия, осигурени от лизиращия буфер.

След лизиране на пробата се използва центрофужна епруветка за процедурата на пречистване.Пробата се зарежда в центрофужната епруветка и след това се центрофугира.

Тази процедура е метод за екстракция на твърда фаза, при който неподвижната фаза се състои от матрица от силикагел.

При оптимални условия на сол и pH, молекулите на РНК се свързват със силициевата мембрана.

В същото време протеинът и други замърсители се отстраняват.

След центрофугиране поставете епруветката на центрофугата в чиста епруветка за събиране, изхвърлете филтрата и след това добавете промивен буфер.

Поставете отново епруветката в центрофугата, за да принудите промивния буфер да премине през мембраната.Това ще премахне всички останали примеси от мембраната, оставяйки само РНК, свързана със силикагела.

След като пробата се измие, поставете епруветката в чиста микроцентрофужна епруветка и добавете елуиращия буфер.

След това се центрофугира, за да прокара елуиращия буфер през мембраната.Буферът за елуиране премахва вирусната РНК от центрофугиращата колона и получава пречистена РНК без протеини, инхибитори и други замърсители.

СТЪПКА 2

Смесен концентрат

След извличане на вирусната РНК, следващата стъпка е да се подготви реакционната смес за PCR амплификация.В тази стъпка се използва концентрат.Този концентриран разтвор е предварително смесен концентриран разтвор, състоящ се от предварителна смес, обратна транскриптаза, нуклеотиди, прав праймер, обратен праймер, TaqMan сонда и ДНК полимераза.

Накрая, за завършване на тази реакционна смес, се добавя матрицата на РНК.Епруветките се смесват чрез импулсно завихряне и след това реакционната смес се зарежда в PCR плаката.Плаката за PCR обикновено съдържа 96 ямки и може да анализира множество проби едновременно.

СТЪПКА 3

PCR амплификация

След това поставете плаката в PCR машината, която по същество е термоциклер.

RT-PCR в реално време се използва за откриване на новия коронавирус от 2019 г. чрез усилване на целевата последователност в гена RdrRP, гена E и гена N.Изборът на целевия ген зависи от последователността на праймера и пробата.

Първата стъпка на RT-PCR е обратната транскрипция.Синтезира се първата верига на комплементарна ДНК, която се инициира от PCR обратния праймер, който се свързва с комплементарната част на генома на вирусната РНК.След това обратната транскриптаза добавя ДНК нуклеотиди към 3′-края на праймера, за да синтезира ДНК, комплементарна на вирусната РНК.Температурата и продължителността на този етап зависят от използваните праймери, целева РНК и обратна транскриптаза.

След това се прилага начален етап на денатуриране, което води до денатуриране на РНК-ДНК хибрида.Тази стъпка е необходима за активиране на ДНК полимеразата.В същото време обратната транскриптаза се инактивира.

PCR се състои от поредица от термични цикли.Всеки цикъл се състои от етапи на денатуриране, отгряване и удължаване.

Стъпката на денатуриране включва нагряване на реакционната камера до 95 градуса по Целзий и използването й за денатуриране на двойноверижната ДНК матрица.

В следващия етап реакционната температура се намалява до 58 градуса по Целзий, което позволява на предния праймер да се закали с комплементарната част на неговата едноверижна ДНК матрица.Температурата на отгряване директно зависи от дължината и състава на грунда.

В етапа на удължаване ДНК полимеразата синтезира нова ДНК верига, която е комплементарна на ДНК шаблонната верига.Чрез добавяне на свободни ядра, комплементарни към шаблона в посока 5′ към 3′ от реакционната смес.Температурата на този етап зависи от използваната ДНК полимераза.

След първия цикъл се получава двуверижна ДНК мишена.

След това влезте във втория цикъл.Двуверижната ДНК се денатурира, за да се получат две едноверижни ДНК молекули.

В следващия етап реакционната температура се понижава, праймерите се отгряват към всяка едноверижна ДНК матрица и сондата Taq-man се отгрява към комплементарната част на целевата ДНК.

Сондата TaqMan се състои от флуорофор, ковалентно свързан към 5′-края на олигонуклеотидната сонда.Когато се възбуди от източника на светлина на циклера, флуорофорът излъчва флуоресценция.В допълнение, сондата е съставена от гасител в 3′-края.Близостта на репортерния ген до гасителя предотвратява откриването на флуоресценция.

В етапа на удължаване ДНК полимеразата синтезира нова верига.Когато полимеразата достигне сондата TaqMan, нейната ендогенна 5'нуклеазна активност разцепва сондата, отделяйки багрилото от гасителя.

С всеки цикъл на PCR се освобождават повече молекули на багрилото, което води до увеличаване на интензитета на флуоресценция, пропорционално на броя на синтезираните ампликони.

Този метод позволява да се оцени броят на дадена последователност, присъстваща в пробата.Броят на двойноверижните ДНК фрагменти се удвоява във всеки цикъл.Следователно PCR може да се използва за анализ на много малки проби.

За измерване на флуоресцентен сигнал, волфрамова халогенна лампа, възбуждащ филтър, рефлектор, леща, емисионен филтър и зарядно свързано устройство използвайте CCD камера.

СТЪПКА 4 Откриване

За измерване на флуоресцентен сигнал, волфрамова халогенна лампа, възбуждащ филтър, рефлектор, леща, емисионен филтър и зарядно свързано устройство използвайте CCD камера.

Филтрираната светлина от лампата се отразява от рефлектора, преминава през събирателната леща и се фокусира към центъра на всеки отвор.Тогава флуоресценцията, излъчвана от отвора, се отразява от огледалото, преминава през емисионния филтър и се открива от CCD камерата.Във всеки PCR цикъл самовъзбуждащата се флуорофорна светлина може да бъде открита от CCD.

Той преобразува уловената светлина в цифрови данни.Този метод се нарича PCR в реално време и позволява наблюдение в реално време на хода на PCR реакцията.