PCR (полимеразна верижна реакция) е една от ин витро технологиите за амплификация на ДНК с повече от 30 години история.

PCR технологията е въведена за първи път от Kary Mullis от Cetus, САЩ през 1983 г. Mullis кандидатства за PCR патент през 1985 г. и публикува първата PCR академична статия за науката през същата година.Мълис е удостоен с Нобелова награда за химия през 1993 г. за работата си.

Основни принципи на PCR

PCR може да амплифицира целевите ДНК фрагменти повече от един милион пъти.Принципът е под катализа на ДНК полимераза, като се използва ДНК на родителската верига като шаблон и специфичен праймер като отправна точка за удължаване.Той се възпроизвежда in vitro чрез стъпки като денатурация, отгряване и удължаване.Процесът на ДНК на дъщерната верига, комплементарна на матричната ДНК на родителската верига.

Стандартният PCR процес е разделен на три стъпки:

1.Денатурация: Използвайте висока температура за разделяне на двойни вериги на ДНК.Водородната връзка между двойните вериги на ДНК се разкъсва при висока температура (93-98 ℃).

2. Отгряване: След като двойноверижната ДНК е разделена, намалете температурата, така че праймерът да може да се свърже с едноверижната ДНК.

3. Удължаване: ДНК полимеразата започва да синтезира комплементарни вериги по дължината на ДНК веригите от праймерите, свързани, когато температурата се понижи.Когато удължаването приключи, един цикъл е завършен и броят на ДНК фрагментите се удвоява

Ако повторите тези три стъпки 25-35 пъти, броят на ДНК фрагментите ще се увеличи експоненциално.

Изобретателността на PCR е, че различни праймери могат да бъдат проектирани за различни целеви гени, така че целевите генни фрагменти да могат да бъдат амплифицирани за кратък период от време.

Досега PCR може да бъде разделен на три категории, а именно обикновен PCR, флуоресцентен количествен PCR и цифров PCR.

Първо поколение обикновен PCR

Използвайте обикновен инструмент за PCR амплификация, за да амплифициране на целевия ген, и след това използвайте електрофореза в агарозен гел, за да откриете продукта, може да се направи само качествен анализ.

Основните недостатъци на PCR от първо поколение:

1. Склонност към неспецифично усилване и фалшиво положителни резултати.

2. Откриването отнема много време и операцията е тромава.

3. Може да се направи само качествен тест

Второ поколение PCR в реално време

PCR в реално време, известен също като qPCR, използва флуоресцентни сонди, които могат да показват напредъка на реакционната система и наблюдава натрупването на амплифицирани продукти чрез натрупване на флуоресцентни сигнали и преценява резултатите чрез кривата на флуоресценцията.Може да се определи количествено с помощта на Cq стойност и стандартна крива.

Тъй като qPCR технологията се извършва в затворена система, вероятността от замърсяване е намалена и флуоресцентният сигнал може да бъде наблюдаван за количествено откриване, така че е най-широко използваната в клиничната практика и се е превърнала в доминираща технология в PCR.

Флуоресцентните вещества, използвани при флуоресцентна количествена PCR в реално време, могат да бъдат разделени на: TaqMan флуоресцентна сонда, молекулярни маяци и флуоресцентно багрило.

1) Флуоресцентна сонда TaqMan:

По време на PCR амплификация се добавя специфична флуоресцентна сонда, докато се добавя двойка праймер.Сондата е олигонуклеотид и двата края са белязани с репортерна флуоресцентна група и гасителна флуоресцентна група.

Когато сондата е непокътната, флуоресцентният сигнал, излъчван от репортерната група, се абсорбира от охлаждащата група;по време на PCR амплификацията, 5'-3' екзонуклеазната активност на ензима Taq разцепва и разгражда сондата, правейки репортерната флуоресцентна група и гасител. Флуоресцентната група се отделя, така че системата за наблюдение на флуоресценцията да може да получи флуоресцентния сигнал, тоест всеки път, когато се усилва ДНК верига, се образува флуоресцентна молекула и натрупването на флуоресцентния сигнал е напълно синхронизиран с образуването на PCR продукта.

2) SYBR флуоресцентно багрило:

В PCR реакционната система се добавя излишък от флуоресцентно багрило SYBR.След като флуоресцентното багрило SYBR е неспецифично включено в двойната верига на ДНК, то излъчва флуоресцентен сигнал.Молекулата на багрилото SYBR, която не е включена във веригата, няма да излъчва никакъв флуоресцентен сигнал, като по този начин гарантира флуоресцентния сигнал. Увеличаването на PCR продуктите е напълно синхронизирано с увеличаването на PCR продуктите.SYBR се свързва само с двойноверижна ДНК, така че кривата на топене може да се използва, за да се определи дали PCR реакцията е специфична.

3) Молекулярен маяк:

Това е двойно белязана олигонуклеотидна проба със стволова верига, която образува структура на фиби от около 8 бази в 5 и 3 края.Последователностите на нуклеинова киселина в двата края са комплементарно сдвоени, което води до плътност на флуоресцентната група и групата за охлаждане.Затворете, няма да се получи флуоресценция.

След като се генерира PCR продуктът, по време на процеса на отгряване, средната част на молекулярния маяк се свързва със специфична ДНК последователност и флуоресцентният ген се отделя от гасителния ген, за да произведе флуоресценция.

Основните недостатъци на PCR от второ поколение:

Все още липсва чувствителност и откриването на екземпляри с ниско копие е неточно.

Има влияние на фоновата стойност и резултатът е податлив на смущения.

Когато има PCR инхибитори в реакционната система, резултатите от откриването са податливи на смущения.

Трето поколение дигитален PCR

Цифровата PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) изчислява броя на копията на целевата последователност чрез откриване на крайна точка и може да извърши точно абсолютно количествено откриване без използване на вътрешни контроли и стандартни криви.

Дигиталната PCR използва откриване на крайна точка и не зависи от стойността на Ct (праг на цикъла), така че дигиталната PCR реакция е по-малко повлияна от ефективността на амплификацията и толерантността към инхибиторите на PCR реакцията е подобрена, с висока точност и възпроизводимост.

Поради характеристиките на висока чувствителност и висока точност, той не се намесва лесно от инхибиторите на PCR реакцията и може да постигне истинско абсолютно количествено определяне без стандартни продукти, което се превърна в гореща точка за изследвания и приложения.

Според различните форми на реакционната единица, тя може да бъде разделена на три основни типа: микрофлуидни, чипови и капкови системи.

1) Микрофлуидна цифрова PCR, mdPCR:

Въз основа на микрофлуидната технология се отделя шаблонът на ДНК.Микрофлуидната технология може да реализира нанообновяване на пробата или генериране на по-малки капчици, но капчиците се нуждаят от специален метод на адсорбция и след това се комбинират с PCR реакционната система.mdPCR постепенно се възприема от заместващи други методи.

2) Дигитален PCR на базата на капчици, ddPCR:

Използвайте технологията за генериране на капчици вода в масло, за да обработите пробата на капчици и разделете реакционната система, съдържаща молекули нуклеинови киселини, на хиляди наномащабни капчици, всяка от които не съдържа целевата молекула нуклеинова киселина, която трябва да бъде открита, или съдържа една до няколко целеви молекули нуклеинова киселина, които да бъдат тествани.

3) Базиран на чип цифров PCR, cdPCR:

Използвайте интегрираната технология за път на течността, за да гравирате много микротръби и микрокухини върху силициеви пластини или кварцово стъкло и да контролирате потока на разтвора през различни контролни клапани и да разделите течността на пробата на нанометри с еднакъв размер в реакционните ямки за цифрова PCR реакция, за да постигнете абсолютно количествено определяне.

Основните недостатъци на PCR от трето поколение:

Оборудването и реактивите са скъпи.

Изискванията за качество на шаблона са високи.Ако количеството на шаблона надвишава количеството на микросистемата, ще бъде невъзможно да се определи количествено, а ако е твърде малко, точността на количественото определяне ще бъде намалена.

Фалшиви положителни резултати също могат да бъдат генерирани, когато има неспецифично усилване.