PCR е най-широко използваната технология за амплификация на нуклеинова киселина и се използва широко поради своята чувствителност и специфичност.PCR обаче изисква повтаряща се термична денатурация и не може да се отърве от ограниченията на разчитането на инструменти и оборудване, което ограничава приложението му в клинични полеви тестове.

От началото на 90-те години много лаборатории започнаха да разработват технология за усилване на постоянна температура, която не изисква термична денатурация.Сега те са разработили технология за изотермична амплификация, медиирана от бримка, технология за изотермична амплификация със замяна на нишка, технология за изотермична амплификация с въртящ се кръг и зависимост от последователността на нуклеинова киселина.Технология на изотермично усилване и други технологии. 

Loop-медиирано изотермично усилване

Принципът на амплификация се основава на факта, че ДНК е в състояние на динамично равновесие при около 65°C.Когато който и да е праймер е базово сдвоен и удължен до комплементарната част на двойноверижната ДНК, другата верига ще се дисоциира и ще стане едноверижна.

При тази температура ДНК използва 4 специфични праймера, за да разчита на ДНК полимераза с изместване на веригата, за да направи синтеза на ДНК с изместване на веригата непрекъсната самоциркулация.

Първо определете 6-те специфични региона F3, F2, F1, B1, B2, B3 на целевия ген и след това проектирайте 4 праймера на базата на тези 6 специфични региона (както е показано на фигурата по-долу):

Предният вътрешен праймер (FIP) е съставен от F1c и F2.

Обратният вътрешен праймер (BIP) се състои от B1c и B2, а TTTT се използва като разделител в средата.

Външните праймери F3 и B3 са съставени съответно от F3 и B3 области на целевия ген.

В реакционната система LAMP концентрацията на вътрешния праймер е няколко пъти по-голяма от тази на външния праймер.Вътрешният праймер първо се комбинира с шаблонната верига, за да се синтезира комплементарна верига, за да се образува двойна верига на ДНК.Впоследствие външният праймер се комбинира с шаблонната верига, за да се образува двойна ДНК верига.Под действието на BstDNA полимераза се освобождава комплементарната верига, синтезирана от вътрешния праймер.След поредица от реакции комплементарната верига най-накрая образува единична ДНК верига със структура на дъмбел.

Самата единична верига на ДНК със структурата на дъмбела се използва като шаблон за непрекъснато формиране на преходна ДНК структура на стебло-примка с отворен край.Вътрешните и външните праймери насочват преходната структура на стебло-примка ДНК непрекъснато да претърпява реакции на изместване и удължаване на веригата и накрая да образува множество структури на стволови примки с различни дължини.ДНК смес.

Предимства и недостатъци на изотермично усилване, медиирано от верига

Предимства на LAMP:

(1) Висока ефективност на амплификация, която може ефективно да амплифицира 1-10 копия на целевия ген в рамките на 1 час, а ефективността на амплификация е 10-100 пъти по-висока от обикновената PCR.

(2) Времето за реакция е кратко, специфичността е силна и не се изисква специално оборудване.

Недостатъци на LAMP:

(1) Изискванията към грундовете са особено високи.

(2) Амплифицираният продукт не може да се използва за клониране и секвениране, а може да се използва само за преценка.

(3) Поради силната си чувствителност е лесно да се образуват аерозоли, което води до фалшиви положителни резултати и засяга резултатите от теста.

Sтранд изместване усилване

Амплификацията с изместване на верига (SDA) е in vitro изотермична техника за амплификация на ДНК, базирана на ензимна реакция, предложена за първи път от американския учен Уокър през 1992 г.

Основната система на SDA включва рестрикционна ендонуклеаза, ДНК полимераза с активност на изместване на веригата, две двойки праймери, dNTPs и калциеви и магнезиеви йони и буферни системи.

Принципът на амплификация с изместване на веригата се основава на химически модифицираната последователност за разпознаване на рестрикционна ендонуклеаза в двата края на таргетната ДНК.Ендонуклеазата отваря празнината във веригата ДНК на нейното място за разпознаване, а ДНК полимеразата разширява празнината 3′ край и замества следващата ДНК верига.

Заменените единични вериги на ДНК могат да се комбинират с праймери и да се удължат в двойни вериги чрез ДНК полимераза.Този процес се повтаря непрекъснато, така че целевата последователност да се усилва ефективно.

Предимства и недостатъци на технологията за усилване с изместване на нишки

Предимства на SDA:

Ефективността на усилване е висока, времето за реакция е кратко, специфичността е силна и не се изисква специално оборудване.

Недостатъци на SDA:

Продуктите не са еднородни и някои едноверижни и двуверижни продукти винаги се произвеждат в SDA цикъла и неизбежно ще настъпи изоставане, когато се открие чрез електрофореза.

Rусилване на кръговия кръг

Усилване на въртящ се кръг (RCA) се предлага чрез използване на метода за копиране на ДНК от патогенни организми чрез въртящ се кръг.Отнася се до използването на едноверижна кръгова ДНК като матрица при постоянна температура и специална ДНК полимераза (като Phi29) ) Под действието на въртящ се кръгов ДНК синтез за постигане на амплификация на целевия ген.

RCA може да се раздели на линейно усилване и експоненциално усилване.Ефективността на линейния RCA може да достигне 10⁵пъти, а ефективността на експоненциалния RCA може да достигне 10⁹пъти.

Просто разграничение, както е показано на фигурата по-долу, линейното усилване a използва само 1 праймер, експоненциалното усилване b има 2 праймера.

Линейният RCA се нарича също единичен праймер RCA.Праймерът се свързва с кръговата ДНК и се удължава чрез действието на ДНК полимераза.Продуктът е линейна единична нишка с голям брой повтарящи се последователности, хиляди пъти по-големи от дължината на единичен цикъл.

Тъй като продуктът на линейния RCA винаги е свързан към началния праймер, лесното фиксиране на сигнала е основно предимство.

Експоненциална RCA, известна още като хиперразклонена амплификация HRCA (Hyper разклонена RCA), при експоненциалната RCA един праймер усилва RCA продукта, вторият праймер хибридизира с RCA продукта и се удължава, а заместителят вече е свързан с RCA продукта Праймерите надолу по веригата разширяват нишката и повтарят удължаването и заместването, за да произведат дендритен RCA амплификационен продукт.

Предимствата и недостатъците на амплификацията на нуклеинова киселина с въртящ се кръг

Предимства на RCA:

Висока чувствителност, добра специфичност и лесна работа.

Недостатъци на RCA:

Фонови проблеми по време на откриване на сигнал.По време на RCA реакцията нециркулиращата катинарска сонда и шаблонната ДНК или РНК на несвързаната сонда могат да генерират някои фонови сигнали. 

Nамплификация на базата на последователност на уклеинова киселина

Амплификацията на базата на нуклеинова киселина (NASBA) е нова технология, разработена на базата на PCR.Това е непрекъсната и изотермична амплификация на нуклеинова киселина, ръководена от двойка праймери с Т7 промоторна последователност.Технологията може да амплифицира матричната РНК около 109 пъти за около 2 часа, което е 1000 пъти по-високо от конвенционалния PCR метод и не изисква специално оборудване.

Тази технология е използвана за бърза диагностика на заболявания веднага щом се появи и много компании в момента използват този метод в комплекти за откриване на РНК.

Въпреки че РНК амплификацията може също да използва PCR технология с обратна транскрипция, NASBA има своите предимства: може да се извършва при относително постоянни температурни условия и е по-стабилна и точна от традиционната PCR технология.

Реакцията е при 41 градуса по Целзий и изисква AMV (вирус на миелобластоза по птиците) обратна транскриптаза, РНКаза Н, Т7 РНК полимераза и двойка праймери, за да завърши.

Процесът включва основно:

Предният праймер съдържа комплементарната последователност на Т7 промотора.По време на реакцията предният праймер се свързва с веригата на РНК и се катализира от ензима AMV, за да образува двойна верига ДНК-РНК.

РНКаза Н усвоява РНК в хибридната двойна верига и запазва едноверижната ДНК.

Под действието на обратния праймер и ензима AMV се образува двойна верига на ДНК, съдържаща Т7 промоторната последователност.

Под действието на Т7 РНК полимеразата процесът на транскрипция завършва и се произвежда голямо количество целева РНК.

Предимства на NASBA:

(1) Неговият праймер има Т7 промоторна последователност, но чуждата двойноверижна ДНК няма Т7 промоторна последователност и не може да бъде амплифицирана, така че тази технология има висока специфичност и чувствителност.

(2) NASBA директно включва процеса на обратна транскрипция в реакцията на амплификация, съкращавайки времето за реакция.

Недостатъци на NASBA:

(1) Реакционните компоненти са по-сложни.

(2) Необходими са три вида ензими, за да се повиши цената на реакцията.