Ct стойността е най-важната форма за представяне на резултатите от флуоресцентната количествена PCR.Използва се за изчисляване на разликите в генната експресия или броя на генните копия.И така, каква е стойността на Ct на количественото определяне на флуоресценцията, която се счита за разумна?Как да осигурим ефективния обхват на стойността на Ct?
Какво е Ct стойност?
По време на процеса на qPCR амплификация, съответният брой цикли на амплификация (Праг на цикъла), когато флуоресцентният сигнал на амплифицирания продукт достигне зададения праг на флуоресценция.C означава Цикъл, а T означава Праг.Казано по-просто, стойността на Ct е броят цикли, съответстващи на момента, в който първоначалната амплификация на шаблона достигне определено количество продукт в qPCR.Така нареченото „определено количество продукт“ ще бъде обяснено допълнително по-късно.
Какво прави стойността на Ct?
1. Връзка между експоненциалното усилване, количеството на шаблона и стойността на Ct
В идеалния случай гените в qPCR се натрупват чрез експоненциално усилване след определен брой цикли.Връзката между броя на циклите на амплификация и количеството на продуктите е: Количество на амплифициран продукт = първоначално количество на шаблона × (1+En) брой цикли.Въпреки това, qPCR реакцията не винаги е в идеална ситуация.Когато количеството на усиления продукт достигне „определено количество на продукта“, броят на циклите в този момент е стойността на Ct и е в експоненциалния период на усилване.Връзката между стойността на Ct и количеството на началния шаблон: Има линейна връзка между стойността на Ct на шаблона и логаритъма от номера на началното копие на шаблона.Колкото по-висока е първоначалната концентрация на шаблона, толкова по-малка е стойността на Ct;колкото по-ниска е първоначалната концентрация на шаблона, толкова по-голяма е стойността на Ct.
2. Крива на амплификация, праг на флуоресценция и определено количество PCR продукт
Количеството продукт на qPCR амплификация се представя директно под формата на флуоресцентен сигнал, тоест кривата на амплификация.В ранния етап на PCR амплификацията е при идеални условия, броят на циклите е малък, натрупването на продукта е малко и нивото на флуоресценция не може да бъде ясно разграничено от фона на флуоресценцията.След това флуоресценцията се увеличава и навлиза в експоненциална фаза.Количеството PCR продукт може да бъде открито в определен момент, когато PCR реакцията е точно в експоненциалната фаза, която може да се използва като „определено количество продукт“ и първоначалното съдържание на шаблона може да бъде изведено от това.Следователно интензитетът на флуоресцентния сигнал, съответстващ на определено количество продукт, е прагът на флуоресценция.
В късния етап на PCR кривата на амплификация вече не показва експоненциална амплификация и навлиза в линейна фаза и фаза на плато.
3. Възпроизводимост на стойностите на Ct
Когато PCR цикълът достигне номера на цикъла на стойността на Ct, той току-що е навлязъл в истинския експоненциален период на амплификация.По това време малката грешка не е усилена, така че възпроизводимостта на стойността на Ct е отлична, тоест един и същ шаблон се усилва по различно време или в различни епруветки по едно и също време.Усилване, получената стойност на Ct е постоянна.
1. Ефективност на усилване En
Ефективността на PCR амплификация се отнася до ефективността, с която полимеразата преобразува гена, който трябва да бъде амплифициран, в ампликон.Ефективността на амплификацията, когато една ДНК молекула се трансформира в две ДНК молекули, е 100%.Ефективността на усилване обикновено се изразява като En.За да се улесни анализът на следващите статии, накратко се представят факторите, които влияят на ефективността на усилване.
| Влияещи фактори | обяснение | Как да съдим? |
| А. PCR инхибитори | 1. Шаблонната ДНК съдържа вещества, които инхибират PCR реакцията, като протеини или детергенти.2. cDNA след обратна транскрипция съдържа висока концентрация на матрична РНК или компоненти на RT реагент, които също могат да инхибират последващата PCR реакция. | 1. Дали има замърсяване може да се прецени чрез измерване на съотношението на А260/А280 и А260/А230 или РНК електрофореза.2. Дали cDNA е разредена според определено съотношение след обратна транскрипция. |
| Б. Неправилен дизайн на грунд | Грундовете не се отгряват ефективно | Проверете праймерите за праймери-димери или фиби, несъответствия и понякога обхващащи intronic дизайни. |
| C. Неправилен дизайн на програмата за PCR реакция | 1. Грундовете не могат ефективно да се темперират2. Недостатъчно освобождаване на ДНК полимераза 3. Дългосрочната активност на ДНК полимеразата при висока температура е намалена | 1. Температурата на отгряване е по-висока от TM стойността на грунда2. Времето за предденатурация е твърде кратко 3. Времето на всеки етап от реакционната процедура е твърде дълго |
| D. Недостатъчно смесване на реагенти или грешки при пипетиране | В реакционната система локалната концентрация на компонентите на PCR реакцията е твърде висока или неравномерна, което води до неекспоненциално усилване на PCR усилване | |
| E. Дължина на ампликона | Дължината на ампликона е твърде дълга, надвишава 300 bp, а ефективността на усилване е ниска | Проверете дали дължината на ампликона е между 80-300 bp |
| F. Влияние на qPCR реагентите | Концентрацията на ДНК полимераза в реагента е ниска или концентрацията на йони в буфера не е оптимизирана, в резултат на което активността на ензима Taq не достига максимума | Определяне на ефективността на усилване чрез стандартна крива |
2. Диапазон на стойностите на Ct
Стойностите на Ct варират от 15-35.Ако стойността на Ct е по-малка от 15, се счита, че амплификацията е в обхвата на базовия период и прагът на флуоресценция не е достигнат.В идеалния случай има линейна зависимост между стойността на Ct и логаритъма на първоначалния номер на копие на шаблона, тоест стандартната крива.Чрез стандартната крива, когато ефективността на амплификацията е 100%, изчислената стойност на Ct за количествено определяне на единичния брой копия на гена е около 35. Ако е по-голям от 35, първоначалният брой копия на шаблона е теоретично по-малък от 1, което може да се счита за безсмислено.
За различни Ct диапазони на ген, поради разликата в броя на генните копия и ефективността на амплификация в първоначалното количество на шаблона, е необходимо да се направи стандартна крива за гена и да се изчисли линейният диапазон на откриване на гена.
3. Фактори, влияещи върху стойността на Ct
От връзката между броя на циклите на усилване и количеството на продукта: количеството на усиления продукт = количеството на първоначалния шаблон × (1+En) номер на цикъл, може да се види, че при идеални условия количеството на първоначалния шаблон и En ще имат отрицателно въздействие върху стойността на Ct.Разликата в качеството на шаблона или ефективността на усилване ще доведе до твърде голяма или твърде малка стойност на Ct.
4.Ct стойността е твърде голяма или твърде малка
Време на публикуване: 22 февруари 2023 г
