Загубата на слуха (HL) е най-често срещаното заболяване на сензорните увреждания при хората.В развитите страни около 80% от случаите на прелингвална глухота при деца са причинени от генетични фактори.Най-честите са едногенни дефекти (както е показано на фиг. 1), 124 генни мутации са установени като свързани с несиндромна загуба на слуха при хора, останалите са причинени от фактори на околната среда.Кохлеарен имплант (електронно устройство, поставено във вътрешното ухо, което осигурява електрическа стимулация директно на слуховия нерв) е най-ефективният вариант за лечение на тежка HL, докато слухов апарат (външно електронно устройство, което преобразува и усилва звуковите вълни) може да помогне на пациентите с умерена HL.Понастоящем обаче няма налични лекарства за лечение на наследствен HL (GHL).През последните години генната терапия получи все по-голямо внимание като обещаващ подход за лечение на дисфункция на вътрешното ухо.

Фиг. 1.Разпределение на типа вариация, свързана с глухота.[1]

Наскоро учени от института Salk и университета в Шефилд публикуваха резултат от изследване в Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], който показа широки перспективи за приложение на in vivo генна терапия на наследствена глухота.Ури Манор, асистент научен професор в Института Салк и директор на Центъра за усъвършенствана биофотоника Уейт, каза, че е роден с тежка загуба на слуха и смята, че възстановяването на слуха би било чудесен подарък.Неговите предишни изследвания установиха, че Eps8 е актинов регулаторен протеин с активност на свързване и затваряне на актин;в кохлеарните космени клетки протеиновият комплекс, образуван от Eps8 с MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 и GNAI3, съществува главно в повечето. Върховете на дългите стереоцилии, които заедно с MYO15A локализират BAIAP2L2 на върховете на по-късите стереоцилии, са необходими за поддържането на снопове косми.Следователно Eps8 може да регулира дължината на стереоцилиите на космените клетки, което е от съществено значение за нормалната функция на слуха;Изтриването или мутацията на Eps8 ще доведе до къси стереоцилии, което го прави неспособен да преобразува правилно звука в електрически сигнали за мозъчно възприемане, което от своя страна води до глухота..В същото време сътрудникът Уолтър Маркоти, професор в университета в Шефилд, установи, че космените клетки не могат да се развиват нормално в отсъствието на Eps8.В това проучване Manor и Marcotti се обединиха, за да проучат дали добавянето на Eps8 към стереоцилиарни клетки може да възстанови тяхната функция и на свой ред да подобри слуха при мишки.Изследователският екип използва адено-асоциирания вирус (AAV) вектор Anc80L65, за да достави кодиращата последователност, съдържаща див тип EPS8, в кохлеята на Eps8-/- новородени P1-P2 мишки чрез инжектиране на кръгла прозоречна мембрана;в миши кохлеарни космени клетки. Функцията на стереоцилиите е възстановена преди да узреят;и ремонтният ефект се характеризира с технология за изобразяване и измерване на стереоцилиите.Резултатите показват, че Eps8 увеличава дължината на стереоцилиите и възстановява функцията на космените клетки в нискочестотните клетки.Те също така установиха, че с течение на времето клетките изглежда губят способността си да бъдат спасявани от тази генна терапия.Изводът е, че това лечение може да се наложи да се приложи in utero, тъй като Eps8-/- космените клетки може да са узрели или да са натрупали непоправимо увреждане след раждането на мишките.„Eps8 е протеин с много различни функции и има още много за изследване“, каза Манор.Бъдещите изследвания ще включват изследване на ефекта от генната терапия Eps8 при възстановяване на слуха на различни етапи на развитие и дали е възможно да се удължат възможностите за лечение.По случайност, през ноември 2020 г. професор KarenB Avraham от университета в Тел Авив в Израел публикува своите резултати в списанието EMBO Molecular Medicine [3], използвайки иновативна технология за генна терапия за създаване на безвреден синтетичен адено-асоцииран вирус AAV9-PHP.B, Генният дефект в клетките на космите на мишки Syne4-/- беше поправен чрез инжектиране на вирус, носещ кодиращата последователност на Syne4 във вътрешното ухо на мишки, позволявайки му да навлезе в клетките на космите и да освободи пренесения генетичен материал, позволявайки им да узреят и да функционират нормално (както на фиг. 2).

Фиг.2.Схематично представяне на анатомията на вътрешното ухо, с акцент върху органа на Корти и клетъчната функция на nesprin-4.

Може да се види, че използването на генна терапия за постигане на целта за лечение на наследствени заболявания на генно ниво чрез вмъкване, премахване или коригиране на всякакви мутирали гени за лечение (т.е. контролиране на генетичните промени в заболяването) има висок клиничен ефект.перспективи за приложение.Настоящите методи за генна терапия за генетично дефицитна глухота могат да бъдат разделени в следните категории:

заместване на ген

Замяната на ген е може би най-„простата“ форма на генна терапия, базирана на идентифициране и заместване на дефектен ген с нормално или диво копие на гена.Първо успешно проучване за генна терапия на вътрешното ухо за загуба на слуха, причинена от делеция на гена за везикуларен глутаматен транспортер 3 (VGLUT3);AAV1-медиирано доставяне на екзогенна свръхекспресия на VGLUT3 в космени клетки на вътрешното ухо (IHC) може да доведе до продължително възстановяване на слуха, частично възстановяване на синаптична морфология на лентата и конвулсивни реакции [4].Въпреки това, в примерите, включващи двата генни заместителя, доставени с AAV, описани във въведението по-горе, е важно да се отбележи, че моделите на мишки, използвани за определени видове наследствени нарушения на слуха с делеция на ген, са временно различни от хората, а при P1 мишки вътрешното ухо е в зрял стадий на развитие.За разлика от тях, хората се раждат със зряло вътрешно ухо.Тази разлика предотвратява възможното прилагане на резултатите от мишка за лечение на човешки наследствени нарушения на глухотата, освен ако генната терапия не се прилага към зрели уши на мишка.

Редактиране на гени: CRISPR/Cas9

В сравнение с „замяната на ген“, развитието на технологията за редактиране на гени доведе до зората на лечението на генетични заболявания от корена.Важно е, че методът за редактиране на ген компенсира недостатъците на традиционните методи за генна терапия със свръхекспресия, които не са подходящи за доминантни наследствени заболявания на глухота, както и проблема, че методът на свръхекспресия не трае дълго.След като китайски изследователи специално нокаутират мутантния алел Myo6C442Y в Myo6WT/C442Y мишки, използвайки системата за редактиране на ген AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2, и в рамките на 5 месеца след нокаута, мишките Слуховата функция на модела е възстановена;в същото време беше също така наблюдавано, че степента на оцеляване на космените клетки във вътрешното ухо се подобри, формата на ресничките стана правилна и електрофизиологичните показатели бяха коригирани [5].Това е първото проучване в света, което използва технологията CRISPR/Cas9 за лечение на наследствена глухота, причинена от мутация на ген Myo6, и е важен изследователски напредък на технологията за редактиране на гени за лечение на наследствена глухота.Клиничният превод на лечението осигурява солидна научна основа.

Методи за доставяне на генна терапия

За да бъде успешна генната терапия, голите ДНК молекули не могат да проникнат ефективно в клетките поради тяхната хидрофилност и отрицателен заряд на фосфатните групи и за да се гарантира целостта на допълнените молекули на нуклеинова киселина, трябва да бъде избран безопасен и ефективен метод.Добавената ДНК се доставя до целевата клетка или тъкан.AAV се използва широко като средство за доставяне за лечение на заболявания поради неговия висок инфекциозен ефект, ниска имуногенност и широк тропизъм към различни видове тъкани.Понастоящем голяма част от изследователската работа е определила тропизма на различни подтипове на AAV по отношение на различни типове клетки в кохлеята на мишката.Използването на характеристики за доставка на AAV, комбинирани с клетъчно-специфични промотори, може да постигне клетъчно-специфична експресия, което може да намали нецелевите ефекти.В допълнение, като алтернатива на традиционните AAV вектори, нови синтетични AAV вектори непрекъснато се разработват и показват превъзходна способност за трансдукция във вътрешното ухо, от които AAV2/Anc80L65 е най-широко използваният.Невирусните методи за доставяне могат допълнително да бъдат разделени на физични методи (микроинжектиране и електропорация) и химични методи (базирани на липиди, на полимерна основа и златни наночастици).И двата подхода са използвани при лечението на наследствени нарушения на глухотата и са показали различни предимства и ограничения.В допълнение към носителя за доставяне на генна терапия като носител могат да се използват различни подходи за in vivo прилагане на ген въз основа на различни типове целеви клетки, пътища на приложение и терапевтична ефикасност.Сложната структура на вътрешното ухо затруднява достигането до целевите клетки и разпределението на агентите за редактиране на генома е бавно.Мембранният лабиринт се намира в костния лабиринт на темпоралната кост и включва кохлеарния канал, полукръгъл канал, утрикула и балон.Неговата относителна изолация, минимална лимфна циркулация и отделяне от кръвта чрез кръвно-лабиринтна бариера ограничават ефективното системно доставяне на терапевтични средства само на неонатални мишки.За да се получат вирусни титри, подходящи за генна терапия, е необходимо директно локално инжектиране на вирусни вектори във вътрешното ухо.Установените начини на инжектиране включват [6]: (1) мембрана с кръгъл прозорец (RWM), (2) трахеостомия, (3) ендолимфатична или перилимфатична кохлеостомия, (4) мембрана с кръгъл прозорец плюс тръбна фенестрация (CF) (както на фиг. 3).

Фиг.3.Доставяне на генна терапия във вътрешното ухо.

Въпреки че е постигнат много напредък в генната терапия въз основа на клинични транслационни цели, трябва да се свърши още работа, преди генната терапия да може да се превърне в първа линия за лечение на пациенти с генетични заболявания, особено при разработването на безопасни и ефективни вектори и метод на доставяне.Но ние вярваме, че в близко бъдеще тези видове лечение ще се превърнат в основен елемент от персонализираната терапия и ще имат изключително положително въздействие върху живота на хората с генетични заболявания и техните семейства.

Foregene пусна също високопроизводителен комплект за скрининг за целеви гени, който е бърз и може да извършва обратна транскрипция и qPCR реакции без екстракция на РНК.

Продуктови връзки

Комплект Cell Direct RT-qPCR—Taqman/SYBR GREEN I

За повече информация за продукта, моля свържете се с:

overseas@foregene.com