Технологията за молекулярна диагностика използва методи на молекулярна биология за откриване на експресията и структурата на генетичния материал на човешкото тяло и различни патогени, така че да постигне целта за прогнозиране и диагностициране на заболявания.

През последните години, с надграждането и итерацията на технологията за молекулярна диагностика, клиничното приложение на молекулярната диагностика става все по-обширно и задълбочено, а пазарът на молекулярна диагностика навлезе в период на бързо развитие.

Авторът обобщава обичайните технологии за молекулярна диагностика на пазара и е разделен на три части: първата част представя PCR технологията, втората част представя технологията за изотермична амплификация на нуклеинова киселина и втората част представя технологията за секвениране.

01

Част I: PCR технология

PCR технология

PCR (полимеразна верижна реакция) е една от in vitro технологиите за амплификация на ДНК с повече от 30 години история.

PCR технологията е въведена за първи път през 1983 г. от Kary Mullis от Cetus, САЩ.Мълис кандидатства за PCR патент през 1985 г. и публикува първата PCR академична статия за науката през същата година.Мълис печели Нобелова награда за химия през 1993 г.

Основни принципи на PCR

PCR може да амплифицира целевите ДНК фрагменти повече от един милион пъти.Принципът е, че при катализата на ДНК полимеразата ДНК на родителската верига се използва като шаблон, а специфичен праймер се използва като начална точка за удължаване.Той се възпроизвежда in vitro чрез стъпки като денатурация, отгряване и удължаване.Процесът на ДНК на дъщерната верига, комплементарна на матричната ДНК на родителската верига.

Стандартният PCR процес е разделен на три стъпки:

1. Денатурация: Използвайте висока температура за разделяне на двойни вериги на ДНК.Водородните връзки между двойните вериги на ДНК се разкъсват при високи температури (93-98°C).

2. Отгряване: След като двойноверижната ДНК се раздели, температурата се понижава, така че праймерът да може да се свърже с едноверижната ДНК.

3. Удължаване: ДНК полимеразата започва да синтезира комплементарни вериги по протежение на ДНК веригите от праймерите, свързани, когато температурата се понижи.Когато удължаването приключи, един цикъл е завършен и броят на ДНК фрагментите се удвоява.

Ако повторите тези три стъпки 25-35 пъти, броят на ДНК фрагментите ще се увеличи експоненциално.

Изобретателността на PCR е, че различни праймери могат да бъдат проектирани за различни целеви гени, така че целевите генни фрагменти да могат да бъдат амплифицирани за кратък период от време.

Досега PCR може да бъде разделен на три категории, а именно обикновен PCR, флуоресцентен количествен PCR и цифров PCR.

Първо поколение обикновен PCR

Използвайте обикновен инструмент за PCR амплификация, за да амплифициране на целевия ген, и след това използвайте електрофореза в агарозен гел, за да откриете продукта, може да се направи само качествен анализ.

Основните недостатъци на PCR от първо поколение:

- Склонност към неспецифично усилване и фалшиво положителни резултати.

-Откриването отнема много време и операцията е тромава.

-Може да се направи само качествено изследване.

Второ поколение флуоресцентна количествена PCR

Флуоресцентната количествена PCR (PCR в реално време), известна още като qPCR, се използва за наблюдение на натрупването на амплифицирани продукти чрез натрупване на флуоресцентни сигнали чрез добавяне на флуоресцентни сонди, които могат да покажат напредъка на реакционната система, и за преценка на резултатите чрез флуоресцентната крива и може да бъде количествено определена с помощта на Cq стойност и стандартна крива.

Тъй като qPCR технологията се извършва в затворена система, вероятността от замърсяване е намалена и флуоресцентният сигнал може да бъде наблюдаван за количествено откриване, така че е най-широко използваната в клиничната практика и се е превърнала в доминираща технология в PCR.

Флуоресцентните вещества, използвани при флуоресцентна количествена PCR в реално време, могат да бъдат разделени на: TaqMan флуоресцентни сонди, молекулярни маяци и флуоресцентни багрила.

1) Флуоресцентна сонда TaqMan:

По време на PCR амплификацията се добавя специфична флуоресцентна сонда, докато се добавя двойка праймери.Сондата е олигонуклеотид и двата края са съответно белязани с репортерна флуоресцентна група и гасителна флуоресцентна група.

Когато сондата е непокътната, флуоресцентният сигнал, излъчван от репортерната група, се абсорбира от охлаждащата група;по време на PCR амплификацията, 5'-3' екзонуклеазната активност на ензима Taq разцепва и разгражда сондата, правейки репортерната флуоресцентна група и гасител. Флуоресцентната група се отделя, така че системата за наблюдение на флуоресценцията да може да получи флуоресцентния сигнал, тоест всеки път, когато се усилва ДНК верига, се образува флуоресцентна молекула и натрупването на флуоресцентния сигнал е напълно синхронизиран с образуването на PCR продукта.

2) SYBR флуоресцентни багрила:

В PCR реакционната система се добавя излишък от флуоресцентно багрило SYBR.След като флуоресцентното багрило SYBR е неспецифично включено в двойната верига на ДНК, то излъчва флуоресцентен сигнал.Молекулата на багрилото SYBR, която не е включена във веригата, няма да излъчва никакъв флуоресцентен сигнал, като по този начин гарантира флуоресцентния сигнал. Увеличаването на PCR продуктите е напълно синхронизирано с увеличаването на PCR продуктите.SYBR се свързва само с двойноверижна ДНК, така че кривата на топене може да се използва, за да се определи дали PCR реакцията е специфична.

3) Молекулярни маяци

Това е двойно белязана олигонуклеотидна проба със стволова верига, която образува структура на фиби от около 8 бази в 5 и 3 края.Последователностите на нуклеинова киселина в двата края са комплементарно сдвоени, което води до плътност на флуоресцентната група и групата за охлаждане.Затворете, няма да произведе флуоресценция.

След като се генерира PCR продуктът, по време на процеса на отгряване, средната част на молекулярния маяк се свързва със специфична ДНК последователност и флуоресцентният ген се отделя от гасителния ген, за да произведе флуоресценция.

Основните недостатъци на PCR от второ поколение:

Чувствителността все още липсва и откриването на проби с ниско копие не е точно.

Има влияние на фоновата стойност и резултатът е податлив на смущения.

Трето поколение дигитален PCR

Цифровата PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) изчислява броя на копията на целевата последователност чрез откриване на крайна точка и може да извърши точно абсолютно количествено откриване без използване на вътрешни контроли и стандартни криви.

Дигиталната PCR използва откриване на крайна точка и не зависи от стойността на Ct (праг на цикъла), така че дигиталната PCR реакция е по-малко повлияна от ефективността на амплификацията и толерантността към инхибиторите на PCR реакцията е подобрена, с висока точност и възпроизводимост.

Поради характеристиките на висока чувствителност и висока точност, той не се намесва лесно от инхибиторите на PCR реакцията и може да постигне истинско абсолютно количествено определяне без стандартни продукти, което се превърна в гореща точка за изследвания и приложения.

Според различните форми на реакционната единица, тя може да бъде разделена на три типа: микрофлуидни, чипови и капкови системи.