Изключителната характеристика на PCR реакцията е нейният голям капацитет на усилване и изключително висока чувствителност.За да подобрим ефективността на PCR и ефективността на откриване, ние се ангажираме да подобрим капацитета на PCR амплификация и чувствителността на откриване, но главоболието е в процеса на експеримента.Често възникват фалшиви положителни резултати и много малко количество кръстосано замърсяване на пробата или замърсяване с PCR продукт може да причини фалшиви положителни резултати в експеримента.
Пет вида замърсяване на PCR продукта
Има много причини за заразяване с PCR, които могат грубо да се разделят на следните категории:
Замърсяването на пробата се причинява главно от замърсяване на контейнера за събиране на пробата или когато пробата е поставена, тя изтича извън контейнера поради хлабаво запечатване или пробата е залепена от външната страна на контейнера, което причинява кръстосано замърсяване;Замърсяването води до замърсяване между екземплярите;някои микробни образци, особено вируси, могат да се разпространяват с аерозоли или да образуват аерозоли, което води до взаимно замърсяване.
Основната причина е, че по време на приготвянето на PCR реагенти пистолетът за проби, контейнерът, двойно дестилираната вода и други разтвори са замърсени от матрицата на PCR нуклеинова киселина.
В лабораториите по молекулярна биология и някои лаборатории, които използват клонирани плазмиди като положителни контроли, проблемът със замърсяването с клонирани плазмиди също е често срещан.Тъй като съдържанието на клониращ плазмид в единица обем е доста високо и са необходими повече инструменти и реагенти в процеса на пречистване, а плазмидът в живите клетки е много вероятно да бъде замърсен поради силната способност за растеж и възпроизводство на живите клетки.
Замърсяването на амплифицираните продукти е най-честият проблем на замърсяване при PCR реакциите.Тъй като количеството копия на PCR продукта е голямо (обикновено 1013 копия/ml), което е много по-високо от границата на броя на копията за откриване на PCR, много малко количество замърсяване на PCR продукта може да причини фалшиви положителни резултати.
Аерозолното замърсяване е най-вероятната форма на замърсяване на PCR продуктите и също така е най-лесният за пренебрегване.Образува се от триенето между повърхността на течността и въздуха.Обикновено аерозолно замърсяване може да се образува, когато капакът се отвори, когато пробата се аспирира или дори когато реакционната епруветка се разклати енергично.Според изчисленията една аерозолна частица може да съдържа 48 000 копия, така че причиненото от нея замърсяване е проблем, който заслужава специално внимание.
По-специално, лабораториите за тестване често използват една и съща двойка праймери, за да тестват определен ген.С течение на времето в лабораторното пространство ще се появи голямо количество замърсяване с PCR продукт.Веднъж възникнало такова замърсяване е трудно то да бъде отстранено за кратко време.
За първите три вида замърсяване можем да използваме ефективни средства за избягване, но замърсяването, причинено от PCR продукти, е трудно да се предотврати, особено при изграждането на нестандартни PCR лаборатории.При PCR процеса, когато върхът на пипетата засмуква и издухва течността и капакът на PCR тръбата се отвори, ще се образува аерозол.Молекулите на ДНК, носени от аерозола (един аерозол може да носи десетки хиляди ДНК), са трудни за елиминиране, защото се носят във въздуха.След като бъде въведен следващият кръг от PCR експерименти, неизбежно ще се появят фалшиви положителни резултати.
Както е показано на фигурата по-долу, отрицателната контрола също усилва съответната лента на интерес:
Първата част от този въпрос за PCR замърсяване и предотвратяване е въведена тук.Следващият брой ще ви донесе втора част „Предотвратяване на заразяване с PCR продукти“, така че следете!
Време на публикация: 25 юли 2017 г
