Директната PCR е реакция, която директно използва животински или растителни тъкани за амплификация без екстракция на нуклеинова киселина.В много отношения директният PCR работи като обикновен PCR

Основната разлика е персонализираният буфер, използван при директна PCR, пробата може да бъде директно подложена на PCR реакция без екстракция на нуклеинова киселина, но има съответните изисквания за толерантността на ензимите и съвместимостта на буфера, участващ в директната PCR реакция.

Въпреки че има повече или по-малко инхибитори на PCR в обичайните проби, директният PCR все още може да постигне надеждна амплификация под действието на ензими и буфери.Традиционната PCR реакция изисква висококачествена нуклеинова киселина като матрица, която може да попречи на гладкото протичане на PCR реакцията, ако матрицата съдържа протеини и други примеси.Direct PCR в момента е една от най-популярните технологии в областта на молекулярната диагностика.

01 Директният PCR първоначално е бил използван за животни и растения

Най-ранното приложение на директната PCR е в областта на животни и растения, като кръв, тъкани и косми на плъх, котка, пиле, заек, овца, едър рогат добитък и т.н., листа и семена на растения и т.н., използвани за изследване на генотипизиране, трансгенно, откриване на плазмиди, анализ на нокаут на гени, идентификация на ДНК източник, идентификация на видове, SNP анализ и други области.

Тези полета имат някои общи черти, тоест съдържанието на целевия ген е сравнително високо и извличането на нуклеинова киселина е обезпокоително, така че директният PCR може не само да спести време и да има малко влияние върху резултатите, но и да спести разходи.

Директният PCR, използван за откриване на патогени, е въпрос на последните години, някои производители на PCR реагенти са положили много усилия в тази посока, когато правят иновации.Особено в тази епидемия от COVID-19 на пазара се появиха много такива продукти за откриване, като комплект за откриване на нуклеинови киселини SARS-CoV-2 (метод на мултиплексна PCR флуоресцентна сонда), проучен и разработен от Foregene, който използва технологията RT PCR в реално време (rRT-PCR) за качествено откриване на нуклеинови киселини SARS-CoV-2 в човешки назофарингеален или орофан проби от арингеален тампон.

Foregene е една от компаниите, използващи Direct PCR технология за откриване на нормални ORF1ab, N, E ивариант линии нуклеинови киселини в проби от човешки назофарингеални или орофарингеални тампони, като SARS-CoV-2 B.1.1.7 линия (UK), B.1.351 линия (ZA), B.1.617 линия (IND) и P.1 линия (BR).

02  Реагенти, необходими за директен PCR

Пробен лизат

Пробният лизат може да бъде конфигуриран сами или закупен.Разликата в състава на различните марки лизат ще направи способността за лизиране различна и тогава времето за лизиране ще бъде малко по-различно.Например, за приготвянето на проби от животински тъкани обикновено се препоръчва 30 минути или лизис за една нощ, а разтворът за лизис за вируси варира от 3-10 минути.

PCR основна смес

Препоръчва се използването на ДНК полимераза с горещ старт за подобряване на специфичната амплификация и увеличаване на способността за амплификация.Ядрото на директната PCR е силно толерантна полимераза.

Елиминирайте или инхибирайте компоненти в пробата, които влияят върху амплификацията на ДНК

След като пробата бъде обработена с лизата, протеини, липиди и други клетъчни остатъци ще бъдат освободени, тези вещества ще инхибират PCR реакцията.Следователно директният PCR изисква добавяне на съответно отстраняване или инхибитори, за да се намали влиянието на тези фактори.

03  Колекция от пет точки на знания за директен PCR

Първо, директната PCR технология е директна PCR технология за различни биологични проби.При това техническо условие не е необходимо да се отделя и извлича нуклеиновата киселина, директно да се използва тъканната проба като обект и да се добавят праймери на целевия ген, за да се извърши PCR реакцията.

Второ, Direct PCR технологията е не само традиционна технология за усилване на ДНК шаблон, но също така включва PCR с обратна транскрипция на РНК шаблон.

Трето, Direct PCR технологията не само директно извършва рутинни качествени PCR реакции върху тъканни проби, но също така включва qPCR реакции в реално време, което изисква реакционната система да има силна способност за анти-фонова флуоресцентна интерференция и ендогенна флуоресценция потушава антагонистичната способност.

Четвърто, пробите, насочени от технологията Direct PCR, се нуждаят само от освобождаване на матрици на нуклеинови киселини и не премахват протеини, полизахариди, йони на сол и т.н., които пречат на PCR реакцията.Което изисква полимеразата на нуклеиновата киселина и PCR сместа в реакционната система да имат отлична устойчивост и адаптивност, за да осигурят ензимната активност и точността на репликация при сложни условия.

Пето, тъканната проба, насочена от директна PCR технология без обогатяване с нуклеинова киселина и количеството на матрицата е много малко, което изисква реакционната система да има изключително висока чувствителност и ефективност на амплификация.