Основа на дизайна на грунд (99% проблеми могат да бъдат решени)
1. Дължина на буквара: Учебникът изисква 15-30 bp, обикновено около 20 bp.Действителното състояние е по-добре да бъде 18-24 bp, за да се гарантира специфичността, но колкото по-дълго, толкова по-добре, твърде дългият праймер също ще намали специфичността и ще намали добива.
2. Обхват на амплификация на праймера: 200-500 bp е подходящ и фрагментът може да бъде разширен до 10 kb при определени условия.
3. База за праймер: Съдържанието на G+C трябва да бъде 40-60%, твърде малко G+C усилващ ефект не е добър, твърде много G+C е лесно да се появят неспецифични ленти.ATGC се разпределя най-добре на случаен принцип, като се избягват клъстери от повече от 5 пуринови или пиримидинови нуклеотиди.Мулти-gc за 5' края и междинни последователности за увеличаване на стабилността, избягвайте богат GC в 3' края, без GC за последните 3 бази или без GC за 3 от последните 5 бази.
4. Избягвайте вторичната структура в праймерите и избягвайте комплементацията между два праймера, особено комплементацията в 3' края, в противен случай ще се образува димер на праймера и ще се генерират неспецифични амплифицирани ленти.
5. Базите в 3' края на праймерите, особено последната и предпоследната бази, трябва да бъдат стриктно сдвоени, за да се избегне неуспех на PCR поради несдвоени крайни бази.
6. Праймерите имат или могат да бъдат добавени с подходящи места на разцепване и амплифицираната целева последователност за предпочитане трябва да има подходящи места на разцепване, което е много полезно за анализ на разцепване или молекулярно клониране.
7. Специфичност на праймерите: праймерите не трябва да имат очевидна хомоложност с други последователности в базата данни за последователности на нуклеинова киселина.
8. Научете се да използвате софтуер: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Този онлайн дизайн работи най-добре).
Горното съдържание може да реши най-малко 99% от проблемите с дизайна на грундовете.
Контролирайте детайлите на дизайна на грунда
1. Дължина на грунда
Общата дължина на праймера е 18~30 бази.Като цяло, най-важният фактор, определящ температурата на отгряване на грунда, е дължината на грунда.Температурата на отгряване на праймера обикновено се избира (стойност на Tm -5 ℃), а някои директно използват стойността на Tm.Следните формули могат да се използват за грубо изчисляване на температурата на отгряване на праймерите.
Когато дължината на праймера е по-малка от 20 bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Когато дължината на праймера е по-голяма от 20 bp: 62,3 ℃+0,41 ℃ (%GC)-500/дължина-5 ℃
В допълнение, много софтуер може да се използва и за изчисляване на температурата на отгряване, принципът на изчисление ще бъде различен, така че понякога изчислената стойност може да има малка разлика.За оптимизиране на PCR реакциите се използват най-късите праймери, които осигуряват температури на отгряване не по-ниски от 54 ℃ за най-добра ефективност и специфичност.
Като цяло специфичността на праймера се увеличава с фактор четири за всеки допълнителен нуклеотид, така че минималната дължина на праймера за повечето приложения е 18 нуклеотида.Горната граница на дължината на праймера не е много важна, главно свързана с ефективността на реакцията.Поради ентропията, колкото по-дълъг е праймерът, толкова по-ниска е скоростта, с която той се отгрява, за да се свърже с целевата ДНК, за да образува стабилен двуверижен шаблон за свързване на ДНК полимераза.
Когато се използва софтуер за проектиране на праймери, дължината на праймерите може да се определи от стойността на TM на свой ред, особено за праймери на флуоресцентна количествена PCR, TM=60 ℃ или така трябва да се контролира.
2.GC съдържание
Обикновено съдържанието на G+C в последователностите на праймера е 40%~60%, а съдържанието на GC и стойността на Tm на двойка праймери трябва да бъдат координирани.Ако праймерът има сериозна тенденция към GC или AT, подходящо количество A, T или G и C опашка може да се добави към 5' края на праймера.
3. Температура на отгряване
Температурата на отгряване трябва да бъде с 5 ℃ по-ниска от температурата на освобождаване от веригата.Ако броят на праймерните бази е малък, температурата на отгряване може да се повиши по подходящ начин, което може да увеличи специфичността на PCR.Ако броят на базите е голям, температурата на отгряване може да бъде намалена по подходящ начин.Температурната разлика на отгряване между двойка праймери от 4 ℃ ~ 6 ℃ няма да повлияе на добива на PCR, но в идеалния случай температурата на отгряване на двойка праймери е една и съща, която може да варира между 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Избягвайте областта на вторичната структура на шаблона за усилване
Най-добре е да избягвате областта на вторичната структура на шаблона, когато избирате амплифицирания фрагмент.Стабилната вторична структура на целевия фрагмент може да бъде предвидена и оценена от съответния компютърен софтуер, което е полезно за избор на шаблон.Експерименталните резултати показват, че разширяването често е неуспешно, когато свободната енергия (△G) на областта, която трябва да се разшири, е по-малка от 58,6 lkJ/mol.
5. Несъответствие с таргетната ДНК
Когато амплифицираната целева ДНК последователност е голяма, праймерът може да се свърже с множество части от целевата ДНК, което води до появата на множество ленти в резултата.Този път е необходимо да използвате тестването на софтуера BLAST, уебсайт:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Изберете Подравняване на две последователности (bl2seq).
Поставянето на праймерни последователности в зона 1 и целеви ДНК последователности в зона 2 е взаимозаменяемо и BLAST изчислява комплементарни, антисенс и други възможности, така че потребителите не трябва да забелязват дали и двете вериги са сетивни вериги.Можете също така да въведете GI номера, ако знаете GI номера на последователността в базата данни, така че не е необходимо да поставяте голяма част от последователността.Накрая щракнете върху Подравняване на 3, за да видите дали праймерът има множество хомоложни места в целевата ДНК.
6. Грунд терминал
Краят 3' на грунда е мястото, където започва разширението, така че е важно да се предотврати несъответствието да започне там.Краят 3' не трябва да бъде повече от 3 последователни G или C, защото това ще доведе до погрешно задействане на праймера в областта на G+C обогатена последователност.3'-краят не може да образува вторична структура, освен при специални PCR (AS-PCR) реакции, 3'-краят на праймера не може да бъде несъответстващ.Например, ако кодиращият регион е амплифициран, 3'-краят на праймера не трябва да се прекратява на третата позиция на кодона, тъй като третата позиция на кодона е склонна към дегенерация, което ще повлияе на специфичността и ефективността на амплификацията.Когато използвате праймери за анексиране, вижте таблицата за използване на кодони, обърнете внимание на биологичните предпочитания, не използвайте праймери за анексиране в 3' края и използвайте по-висока концентрация на праймери (1uM-3uM).
7. Вторична структура на праймери
Самите праймери не трябва да имат комплементарни последователности, в противен случай самите праймери ще се сгънат в структури с фиби и тази вторична структура ще повлияе на свързването на праймерите и шаблоните поради пространствено препятствие.Ако се използва изкуствена преценка, непрекъснатите комплементарни бази на самите праймери не трябва да са по-големи от 3bp.Не трябва да има комплементарност между двата праймера, особено комплементарното припокриване на 3' края трябва да се избягва, за да се предотврати образуването на димери на праймера.Като цяло не трябва да има повече от 4 последователни базови хомология или комплементарност между двойка праймери.
8. Добавете маркери или локуси
5'-краят има малък ефект върху специфичността на амплификацията и следователно може да бъде модифициран, без да се засяга специфичността на амплификацията.Модифицирането на праймер 5' края включва: добавяне на ензимен рестрикционен сайт;Белязан биотин, флуоресценция, дигоксин, Eu3+ и т.н. Въведете ДНК последователности, свързващи протеини;Въвеждане на мутационни сайтове, вмъкване и липсващи мутационни последователности и въвеждане на промоторни последователности и т.н. Допълнителните бази повече или по-малко ще повлияят на ефективността на амплификацията и ще увеличат шанса за образуване на димер на праймера, но трябва да се направят някои отстъпки за следващата стъпка.Допълнителни последователности, които не съществуват в целевата последователност, като рестрикционни сайтове и промоторни последователности, могат да бъдат добавени към 5' края на праймера, без да се засяга специфичността.Тези последователности не са включени в изчисляването на стойностите на Tm на праймера, но трябва да бъдат тествани за комплементарност и вътрешна вторична структура.
9. Субклонове
През повечето време PCR е само предварително клониране и след това трябва да субклонираме целевия фрагмент в различни вектори, така че трябва да проектираме допълнителни бази за следващата операция в стъпката на PCR.
Някои последователности, предназначени за субклониране, са обобщени по-долу.
Беше добавено рестрикционно място за рестрикционна ендонуклеаза
Добавянето на ензимни рестрикционни сайтове е най-често използваният метод за субклониране на PCR продукти.Като цяло мястото на разцепване е шест бази, в допълнение към 5' края на мястото на разцепване трябва да добавите 2 ~ 3 защитни бази.Въпреки това, броят на защитните бази, изисквани от различните ензими, е различен.Например SalⅠ не изисква защитна основа, EcoRⅤ изисква 1 защитна основа, NotⅠ изисква 2 защитни основи, а Hind Ⅲ изисква 3 защитни основи.
LIC добавя опашката
Пълното име на LIC е Ligation-Independent cloning, метод на клониране, изобретен от Navogen специално за неговата част от pET вектора.pET носителят, получен чрез LIC метода, има некомплементарни 12-15 базови единични верижни лепкави краища, които допълват съответните лепкави краища на целевия вмъкнат фрагмент.За целите на амплификацията, праймерната 5' последователност на вмъкнатия фрагмент трябва да допълва LIC вектора.Екстранектната активност 3'→5' на Т4 ДНК полимеразата може да образува едноверижен лепкав край върху вмъкнатия фрагмент след кратко време.Тъй като продуктът може да се формира само от взаимното отгряване на подготвения фрагмент на вмъкване и вектора, този метод е много бърз и ефективен и е насочено клониране.
Насочен TA клонинг добави опашка
TA клонирането не успя да насочи фрагмента към вектор, така че по-късно Invitrogen въведе вектор, който може да насочи клонирането, който съдържа четири видни бази GTGGS в единия край.Следователно, при проектирането на PCR праймери, трябва да се добавят съответно допълващи се последователности, така че фрагментите да могат да бъдат „ориентирани“.
Ако нямате време, можете да опитате директен синтез, комбинирайки гена с вектора, което наричаме ET генен синтез при музекулистите.
D. Метод на клониране In-Fusion
Не е необходима лигаза, не е необходима дълга реакция.Докато последователност в двата края на линеаризирания вектор е въведена в дизайна на праймери, тогава PCR продуктът и линеаризираният вектор се добавят към инфузионния ензимен разтвор, съдържащ BSA, и се поставят при стайна температура за половин час, трансформацията може да се извърши.Този метод е особено подходящ за преобразуване на голям обем.
10. Грунд за сливане
Понякога е известна само ограничена информация за последователността относно дизайна на праймера.Например, ако е известна само аминокиселинната последователност, може да се проектира сливащият праймер.Праймерът за сливане е смес от различни последователности, представящи всички различни възможности за основа, които кодират една аминокиселина.За да увеличите специфичността, можете да се обърнете към таблицата за използване на кодони, за да намалите анексията според предпочитанията за базова употреба на различни организми.Хипоксантинът може да се комбинира с всички основи, за да се намали температурата на отгряване на праймера.Не използвайте приложените бази в 3' края на праймера, защото отгряването на последните 3 бази в 3' края е достатъчно, за да започне PCR на грешното място.Използват се по-високи концентрации на праймер (1 μM до 3 μM), тъй като праймерите в много смеси за свързване не са специфични за целевия шаблон.
PCR суровиниконтрол
1. Количество грунд
Концентрацията на всеки праймер е 0,1 ~ 1 umol или 10 ~ 100 pmol.По-добре е да постигнете необходимия резултат с най-малкото количество грунд.Високата концентрация на праймера ще причини несъответствие и неспецифична амплификация и ще увеличи шанса за образуване на димери между праймерите.
2. Концентрация на грунд
Концентрацията на праймерите влияе върху специфичността.Оптималната концентрация на праймера обикновено е между 0,1 и 0,5 μM.По-високите концентрации на праймера водят до амплификация на неспецифични продукти.
3. Температура на отгряване на грунда
Друг важен параметър за грундовете е температурата на топене (Tm).Това е температурата, при която 50% от праймерите и комплементарните последователности са представени като двойноверижни ДНК молекули.Tm е необходим за задаване на температурата на отгряване на PCR.В идеалния случай температурата на отгряване е достатъчно ниска, за да осигури ефективно отгряване на праймерите с целевата последователност, но достатъчно висока, за да намали неспецифичното свързване.Разумна температура на отгряване от 55 ℃ до 70 ℃.Температурата на отгряване обикновено се задава с 5 ℃ по-ниска от Tm на грунда.
Има няколко формули за определяне на Tm, които варират значително в зависимост от използваната формула и последователността на праймерите.Тъй като повечето формули предоставят приблизителна стойност на Tm, всички температури на отгряване са само начална точка.Специфичността може да бъде подобрена чрез анализиране на няколко реакции, които прогресивно повишават температурата на отгряване.Започнете под изчислената Tm-5℃ и постепенно увеличете температурата на отгряване със стъпка от 2℃.По-високата температура на отгряване ще намали образуването на праймери и неспецифични продукти.За най-добри резултати двата праймера трябва да имат приблизителни стойности на Tm.Ако разликата Tm на двойки праймери е повече от 5 ℃, праймерите ще покажат значителен фалстарт чрез използване на по-ниска температура на отгряване в цикъла.Ако двата праймера Tm са различни, задайте температурата на отгряване на 5 ℃ по-ниска от най-ниската Tm.Като алтернатива, за увеличаване на специфичността, пет цикъла могат да бъдат извършени първо при температури на отгряване, предназначени за по-високи Tm, последвани от останалите цикли при температури на отгряване, предназначени за по-ниски Tm.Това позволява да се получи частично копие на целевия шаблон при строги условия.
4. Чистота и стабилност на грунда
Стандартната чистота на персонализираните праймери е подходяща за повечето PCR приложения.Отстраняването на бензоилови и изобутилилови групи чрез обезсоляване е минимално и следователно не пречи на PCR.Някои приложения изискват пречистване, за да се премахнат всякакви последователности, които не са в пълна дължина в процеса на синтез.Тези съкратени последователности възникват, защото ефективността на химията на синтеза на ДНК не е 100%.Това е кръгов процес, който използва повтарящи се химични реакции, тъй като всяка база се добавя, за да се направи ДНК от 3′ до 5′.Можете да се провалите и в двата цикъла.По-дългите праймери, особено тези, по-големи от 50 бази, имат голяма част от съкратени последователности и може да изискват пречистване.
Добивът на праймери се влияе от ефективността на синтетичната химия и метода на пречистване.Биофармацевтичните компании, като Cytology и Shengong, всички използват минимална OD единица, за да осигурят общото производство на олигонуклеозид.Персонализираните грундове се доставят под формата на сух прах.Най-добре е праймерите да се разтворят отново в ТЕ, така че крайната концентрация да е 100 μM.TE е по-добър от дейонизираната вода, тъй като рН на водата често е киселинно и ще причини хидролиза на олигонуклеозиди.
Стабилността на грундовете зависи от условията на съхранение.Сухият прах и разтворените грундове трябва да се съхраняват при -20 ℃.Праймерите, разтворени в TE при концентрации, по-големи от 10 μM, могат да се съхраняват стабилно при -20 ℃ за 6 месеца, но могат да се съхраняват само при стайна температура (15 ℃ до 30 ℃) за по-малко от 1 седмица.Сухите прахообразни грундове могат да се съхраняват при -20 C най-малко 1 година и при стайна температура (15 C до 30 C) до 2 месеца.
5. Ензими и техните концентрации
Понастоящем използваната Taq ДНК полимераза е основно ензимът за генно инженерство, синтезиран от колиформни бактерии.Количеството ензим, необходимо за катализиране на типична PCR реакция, е около 2,5 U (отнася се за общия реакционен обем от 100 ul).Ако концентрацията е твърде висока, това може да доведе до неспецифично усилване;ако концентрацията е твърде ниска, количеството синтетичен продукт ще бъде намалено.
6. Качество и концентрация на dNTP
Качеството на dNTP е тясно свързано с концентрацията и ефективността на PCR амплификацията.Прахът dNTP е гранулиран и неговата променливост губи биологичната си активност, ако се съхранява неправилно.Разтворът на dNTP е кисел и трябва да се използва във висока концентрация, с 1M NaOH или 1M Tris.HCL буферен разтвор за регулиране на неговото PH до 7,0 ~ 7,5, малко количество подопаковки, съхранение в замразено състояние при -20 ℃.Многократното замразяване-размразяване ще влоши dNTP.При PCR реакция dNTP трябва да бъде 50 ~ 200 umol/L.По-специално, трябва да се обърне внимание на концентрацията на четирите DNTPS трябва да бъде еднаква (равна молова подготовка).Ако концентрацията на някой от тях е различна от останалите (по-висока или по-ниска), ще се получи несъответствие.Твърде ниската концентрация ще намали добива на PCR продукти.dNTP може да се комбинира с Mg2+ и да намали концентрацията на свободен Mg2+.
7. Матрична (целеви ген) нуклеинова киселина
Количеството и степента на пречистване на шаблонната нуклеинова киселина е една от ключовите връзки за успеха или неуспеха на PCR.Традиционните методи за пречистване на ДНК обикновено използват SDS и протеаза K за смилане и изхвърляне на проби.Основните функции на SDS са: разтваряне на липиди и протеини на клетъчната мембрана, като по този начин разрушава клетъчната мембрана чрез разтваряне на мембранни протеини и дисоцииране на ядрени протеини в клетката, SDS може също да се комбинира с протеини и да се утаи;Протеаза К може да хидролизира и смила протеини, особено хистони, свързани с ДНК, и след това да използва органичен разтворител фенол и хлороформ за извличане на протеини и други клетъчни компоненти и да използва етанол или изопропилов алкохол за утаяване на нуклеинова киселина.Екстрахираната нуклеинова киселина може да се използва като шаблон за PCR реакции.За образци за общо клинично откриване може да се използва бърз и прост метод за разтваряне на клетки, лизат на патогени, смилане и отстраняване на протеини от хромозоми до свободни целеви гени и директно използване за PCR амплификация.Екстракцията на РНК шаблон обикновено използва метод на гуанидин изотиоцианат или протеаза К, за да се предотврати разграждането на РНКаза от РНК.
8. Концентрация на Mg2+
Mg2+ има значителен ефект върху специфичността и добива на PCR амплификация.При обща PCR реакция, когато концентрацията на различни dNTP е 200 umol/L, подходящата концентрация на Mg2+ е 1,5 ~ 2,0 mmol/L.Концентрацията на Mg2+ е твърде висока, специфичността на реакцията намалява, настъпва неспецифична амплификация, твърде ниската концентрация ще намали активността на Taq ДНК полимеразата, което води до намаляване на реакционните продукти.
Магнезиевите йони засягат няколко аспекта на PCR, като активност на ДНК полимераза, която влияе върху добива;Друг пример е отгряването на праймера, което засяга специфичността.dNTP и матрицата се свързват с магнезиевите йони, намалявайки количеството свободни магнезиеви йони, необходими за ензимната активност.Оптималната концентрация на магнезиев йон варира за различните двойки праймери и шаблони, но типичната начална концентрация на PCR с 200 μM dNTP е 1,5 mM (забележка: За количествена PCR в реално време използвайте 3 до 5 mM разтвор на магнезиев йон с флуоресцентна сонда).По-високите концентрации на свободни магнезиеви йони увеличават добива, но също така увеличават неспецифичното усилване и намаляват точността.За определяне на оптималната концентрация се извършват титрувания на магнезиевите йони на стъпки от 0,5 mM от 1 mM до 3 mM.За намаляване на зависимостта от оптимизирането на магнезиевите йони може да се използва Platinum Taq ДНК полимераза.Platinum Taq ДНК полимераза е в състояние да поддържа функция в по-широк диапазон от концентрации на магнезиеви йони от Taq ДНК полимераза и следователно изисква по-малко оптимизиране.
9. Pcr-стимулиращи добавки
Оптимизирането на температурата на отгряване, дизайна на праймера и концентрацията на магнезиевите йони е достатъчно за силно специфично усилване на повечето шаблони;някои шаблони обаче, включително тези с високо GC съдържание, изискват допълнителни мерки.Добавките, които влияят на температурата на топене на ДНК, осигуряват друг начин за подобряване на специфичността и добива на продукта.За най-добри резултати е необходимо пълно денатуриране на шаблона.
В допълнение, вторичната структура предотвратява свързването на праймера и ензимното удължаване.
PCR добавките, включително формамид, DMSO, глицерин, бетаин и PCRx Enhancer Solution, подобряват амплификацията.Техният възможен механизъм е да намалят температурата на топене, като по този начин подпомагат отгряването на праймерите и подпомагат удължаването на ДНК полимеразата през региона на вторичната структура.PCRx Solution има и други предимства.Необходима е минимална оптимизация на магнезиевите йони, когато се използва с Platinum Taq ДНК полимераза и Platinum Pfx ДНК полимераза.По този начин техниката Platinum се комбинира с добавката за увеличаване на специфичността, като същевременно намалява зависимостта от третия подход, оптимизиране на магнезиевите йони.За най-добри резултати концентрацията на добавките трябва да бъде оптимизирана, особено DMSO, формамид и глицерол, които инхибират Taq ДНК полимераза.
10. Горещ старт
PCR с горещ старт е един от най-важните методи за подобряване на PCR специфичността в допълнение към добрия дизайн на праймера.Въпреки че оптималната температура на удължаване на Taq ДНК полимеразата е 72 ℃, полимеразата остава активна при стайна температура.Така се получават неспецифични продукти, когато температурата на задържане е по-ниска от температурата на отгряване по време на подготовката на PCR реакцията и в началото на термичния цикъл.Веднъж образувани, тези неспецифични продукти се усилват ефективно.PCR с горещ старт е особено ефективен, когато местата, използвани за проектиране на праймера, са ограничени от местоположението на генетични елементи, като насочени към място мутации, експресионно клониране или конструиране и манипулиране на генетични елементи, използвани за ДНК инженерство.
Често срещан метод за ограничаване на активността на Taq ДНК полимеразата е приготвянето на PCR реакционен разтвор върху лед и поставянето му в предварително загрят PCR апарат.Този метод е прост и евтин, но не завършва дейността на ензима и следователно не елиминира напълно амплификацията на неспецифични продукти.
Термичното праймиране забавя синтеза на ДНК чрез инхибиране на основен компонент, докато PCR апаратът достигне температура на денатурация.Повечето методи за ръчно термично иницииране, включително забавено добавяне на Taq ДНК полимераза, са тромави, особено за приложения с висока производителност.Други методи за термично грундиране използват восъчен щит за затваряне на основен компонент, включително магнезиеви йони или ензими, или за физическо изолиране на реактивни компоненти, като шаблони и буфери.По време на термичния цикъл различните компоненти се освобождават и смесват заедно, докато восъкът се топи.Подобно на метода на ръчно горещо стартиране, методът на восъчния щит е тромав и податлив на замърсяване и не е подходящ за приложения с висока производителност.
Платинената ДНК полимераза е удобна и ефективна за автоматичен горещ старт PCR.Platinum Taq ДНК полимераза се състои от рекомбинантна Taq ДНК полимераза, комбинирана с моноклонално антитяло срещу Taq ДНК полимераза.Антителата са формулирани чрез PCR, за да инхибират ензимната активност по време на продължително задържане на температурата.Taq ДНК полимеразата се освобождава в реакцията по време на изолацията при 94 ℃ на етапа на денатуриране, възстановявайки пълната полимеразна активност.За разлика от химически модифицираната Taq ДНК полимераза за термично иницииране, ензимът Platinum не изисква продължителна изолация при 94 ℃ (10 до 15 минути), за да активира полимеразата.С PlatinumTaq ДНК полимераза, 90% от Taq ДНК полимеразната активност се възстановява след 2 минути при 94 ℃.
11. Nest-PCR
Последователните кръгове на амплификация с използване на вложени праймери могат да подобрят специфичността и чувствителността.Първият кръг е стандартно усилване от 15 до 20 цикъла.Малка част от първоначалния продукт на амплификация се разрежда 100 до 1000 пъти и се добавя към втория кръг на амплификация за 15 до 20 цикъла.Алтернативно, първоначалният амплифициран продукт може да бъде оразмерен чрез пречистване с гел.Във втория кръг на амплификация се използва вложен праймер, който може да се свърже с целевата последователност вътре в първия праймер.Използването на вложена PCR намалява възможността за амплификация на множество целеви места, тъй като има малко целеви последователности, допълващи и двата комплекта праймери.Същият общ брой цикли (30 до 40) със същите праймери усилва неспецифичните места.Вложената PCR повишава чувствителността на ограничени целеви последователности (напр. редки мРНК) и подобрява специфичността на трудни PCRS (напр. 5' RACE).
12. Низходящ PCR
Низходящата PCR подобрява специфичността чрез използване на тесни условия на отгряване за първите няколко цикъла на PCR.Цикълът започва при температура на отгряване приблизително с 5 ℃ по-висока от очакваната Tm, след което всеки цикъл се намалява с 1 ℃ до 2 ℃, докато температурата на отгряване стане под Tm 5 ℃.Само целевият шаблон с най-висока хомология ще бъде разширен.Тези продукти продължават да се разширяват в следващите цикли, изтласквайки амплифицираните неспецифични продукти.Низходящата PCR е полезна за методи, при които степента на хомология между праймера и целевата матрица не е известна, като AFLP ДНК пръстови отпечатъци.
Свързани PCR комплекти
2× PCR геройTMMix системата има по-висока толерантност към PCR инхибитори от обикновената PCR Mix система и може лесно да се справи с PCR амплификация на различни сложни шаблони.Уникалната реакционна система и високоефективният Taq Hero правят PCR реакцията с по-висока ефективност на амплификация, специфичност и чувствителност.
По-висока ефективност на усилване
Има 5'→3' ДНК полимеразна активност и 5'→3' екзонуклеазна активност, без 3'→5' екзонуклеазна активност.
PCR в реално време Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Специфичен—оптимизиран буфер и горещ старт Taq ензим може да предотврати неспецифичното усилване и образуването на димер на праймера
Висока чувствителност—може да открие малки копия на шаблон
Комплектът използва уникален реагент за обратна транскрипция Foregene и ДНК полимераза Foregene HotStar Taq, комбинирани с уникална реакционна система за ефективно подобряване на ефективността на амплификацията и специфичността на реакцията.
Време на публикуване: 9 май 2023 г
