Вярвам, че всеки винаги ще се сблъска с такива или такива проблеми, когато прави PCR реакции, но повечето от тях могат да бъдат класифицирани в два основни проблема:

Твърде малко усилване на генния шаблон (амплификация);
Твърде много амплификация на нецелеви гени.
Използването на добавки е една от често срещаните стратегии за решаване на тези проблеми.Обикновено ролята на добавките има два аспекта:
вторична структурана гените (вторична структура);
Намалете неспецифичното грундиране.
Днес редакторът ще ви представи накратко обичайните добавки в PCR реакциите и техните функции.
Добавки, които намаляват вторичната структура
сулфоксид(DMSO)
генни пробис високо съдържание на GC.Въпреки това, DMSO също значително намалява Taq полимеразната активност.Следователно всеки трябва да балансира достъпността на шаблона и активността на полимеразата.Редакторът предлага да опитате различни концентрации на DSMO, като например от 2% до 10%, за да намерите концентрацията, която отговаря на вашия експеримент.
Нейонни детергенти
Нейонните детергенти, като 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 или NP-40, обикновено намаляват вторичната структура на ДНК.Въпреки че това може да увеличи амплификацията на шаблонния ген, това също ще причини проблеми с неспецифичната амплификация.И така, тези добавки работят добре за PCR реакции с нисък добив без остатъци, но не толкова добре за относително нечисти PRC реакции.Друго предимство на нейонните детергенти е намаляването на замърсяването с SDS.Обикновено по време на процеса на екстракция на ДНК, SDS ще бъде доведен до етапа на PCR, което силно инхибира активността на полимеразата.Следователно добавянето на 0,5% Tween-20 или Tween-40 към реакцията може да неутрализира отрицателните ефекти на SDS.
Бетаин_
Бетаинът може да подобри амплификацията на ДНК чрез намаляване на образуването на вторична структура и като цяло е „мистериозно“ допълнение към търговските PCR комплекти.Ако искате да използвате бетаин, трябва да поставите бетаин или бетаин монохидрат (Betaine или Betaine mono-hydrate), но не и бетаин хидрохлорид (Betaine HCl), коригирайте до крайна концентрация от 1-1,7M.Бетаинът може също така да помогне за подобряване на специфичността, тъй като елиминира зависимостта на състава на базовата двойка от топенето на ДНК/денатурацията на ДНК.
Добавки за намаляване на неспецифичното грундиране
Формамид
Формамидът е често използвана органична PCR добавка.Може да се комбинира с голяма бразда и малка бразда в ДНК, като по този начин намалява стабилността на двойната спирала на главната ДНК и понижава температурата на топене на ДНК.Концентрацията на формамид, използван в PCR експерименти, обикновено е 1%-5%.
Тетраметиламониев хлорид( TMAC)
Тетраметиламониевият хлорид може да увеличи специфичността на хибридизацията (хибридизационна специфичност) и да повиши температурата на топене на ДНК.По този начин TMAC може да премахне неспецифичното праймиране и да намали неправилното свързване на ДНК и РНК.Ако използватеизродени праймерив PCR реакцията не забравяйте да добавите TMAC, който обикновено се използва в концентрация от 15-100 mM.
Други обичайни добавки
В допълнение към двете категории добавки, споменати по-горе, има много общи добавки в PCR реакциите, въпреки че имат различни функции, те също са много важни.
Магнезиев йон
Магнезиевият йон е незаменим кофактор (кофактор) на полимеразата, т.е. без магнезиев йон полимеразата е неактивна.Въпреки това твърде много магнезиеви йони също могат да повлияят на ефективността на полимеразата.Концентрацията на магнезиевите йони във всяка PCR реакция ще варира.Хелатиращите агенти (като EDTA или цитрат), концентрацията на dNTP и протеините влияят върху концентрацията на магнезиевите йони.Така че, ако имате проблеми с вашия PCR експеримент, можете да опитате да промените различни концентрации на магнезиев йон, например от 1,0 до 4,0 mM, с интервал от 0,5–1 mM между тях.
Струва си да се отбележи, че множеството цикли на замразяване-размразяване могат да доведат до разслояване на концентрацията на разтвора на магнезиев хлорид.Следователно, трябва да го разтворите напълно преди всяка употреба и да го разбъркате добре преди употреба.
Говежди серумен албумин(Говежди албумин, BSA)
В експериментите с молекулярна химия говеждият серумен албумин е много често срещана добавка, особено при храносмилането с рестрикционни ензими и PCR експериментите.При PCR реакции BSA е полезен за намаляване на замърсители като фенолни съединения.И също така се казва, че може да намали адхезията на реагентите към стената на епруветката.При PCR реакцията обикновено концентрацията на добавения BSA може да достигне 0,8 mg/ml.
 
Свързани продукти:
PCR герой(с боя)
PCR герой