Проверката на ефективността на праймерите и пробите в ранния етап на PCR реагентите и определянето на най-подходящите реакционни условия са предпоставките за осигуряване на гладкото протичане на официалните експерименти.
И така, как трябва да потвърдим праймерната сонда в ранния етап?
Основните индикатори са базова линия, крива на усилване, ct стойност, ефективност на усилване, откриване на проба с ниска концентрация, CV и др.
Базово ниво
Базовата линия е хоризонталната линия в кривата на PCR амплификация.В първите няколко цикъла на реакцията на PCR амплификация, флуоресцентният сигнал не се променя много и образува права линия.Тази права линия е основната линия.
Когато скринингирате PCR праймерни сонди, обърнете внимание дали базовата линия е на ниво.Чистотата на концентрацията на праймерната проба ще повлияе на базовата линия, като например ще доведе до покачване или спадане на базовата линия.Базовата линия също е много интуитивен индикатор.
Крива на усилване
Друг интуитивен индикатор е формата на кривата на усилване.Най-добре е да имате S-образна крива, за да избегнете вторично усилване или други необичайни криви на усилване.
Ct стойност
Броят на циклите, съответстващи на инфлексната точка от базовата линия до експоненциалния растеж, е стойността на Ct.
За една и съща проба различни праймерни сонди водят до различни криви на усилване и съответната стойност на Ct ще бъде повлияна от ефективността на усилване и степента на интерференция.На теория, колкото по-малка е стойността на Ct на праймерната сонда, която избираме, толкова по-добре.
Ефективност на усилване
Един от най-надеждните и стабилни методи за оценка на ефективността на PCR амплификация е стандартната крива, която също е широко призната от изследователите.Методът включва създаване на серия от проби за контрол на относителния брой целеви шаблони.Тези проби обикновено се правят чрез серийни разреждания на концентрирани основни разтвори, най-често използваното е 10-кратно разреждане.Използване на серия от разредени проби, използване на стандартна qPCR програма за амплифициране, за да се получи стойността на Cq, и накрая да се начертае стандартна крива според концентрацията на всяка проба и съответната стойност на Cq, за да се получи линейното уравнение Cq= -klgX0+b и ефективността на амплификация E=10(-1 /k)-1.Когато се използва qPCR за количествен анализ, се изисква ефективността на амплификацията да бъде в диапазона от 90%-110% (3,6>k>3,1).
Откриване на проби с ниска концентрация
Когато концентрацията на пробата е ниска, нивата на откриване на различните праймерни сонди са различни.Избираме 20 проби с ниска концентрация за репликация и системата праймер-сонда с най-висок процент на откриване е най-добрата.
Коефициент на вариация (CV)
10 дублирани проби могат да бъдат открити с различни праймерни сонди в съответствие със стандартната линия на реагента за откриване на амплификация на нуклеинова киселина.
Количествени реагенти:
точност
Точността в рамките на една партида трябва да отговаря на: коефициентът на вариация (CV,%) на логаритмичната стойност на тестовата концентрация е ≤5%.Когато концентрацията на пробата е ниска, коефициентът на вариация (CV,%) на логаритъма на концентрацията на откриване е ≤10%
Качествени реактиви:
точност
Точността в рамките на една партида трябва да отговаря на:
(1) Коефициент на вариация на стойността на Ct (CV,%) ≤5%
Една и съща проба се тества паралелно 10 пъти и резултатите от теста трябва да са последователни
Време на публикуване: 18 септември 2021 г
