В ранния стадий на огнището, поради бързото развитие, бързата диагностика на предполагаеми пациенти е ключът към предотвратяването на COVID-19.Някои одобрени реагенти за откриване на нуклеинова киселина имат кратко време за разработка и има проблеми като прибързано потвърждение на ефективността, недостатъчна оптимизация на реагента и големи разлики между партидите;Проблемите на различни клинични лаборатории в различни аспекти на процеса на откриване на нуклеинова киселина също могат да повлияят на точността на резултатите от откриване на нуклеинова киселина.Тази статия ще се съсредоточи върху ключовите връзки и точки в текущото откриване на нуклеинова киселина SARS-CoV-2 и ще анализира проблемите с фалшиво отрицателното и положителното повторно изследване на лабораторното откриване на нуклеинова киселина и клиничното несъответствие.

Принципи на откриване на нуклеинова киселина на SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 е РНК вирус с геномна последователност от около 29 kb, с 10 гена, които могат ефективно да кодират 10 протеина.Вирусите са съставени от РНК и протеин, а най-външният слой е външно покритие, съставено от липиди и гликопротеини.Вътре протеиновият капсид обвива РНК в него, като по този начин защитава лесно разградимата РНК (P1).

P1 Структура на SARS-COV-2

Вирусите нахлуват в клетките чрез специфични рецептори на клетъчната повърхност, за да причинят инфекция и използват клетки гостоприемници за репликация.

Принципът на откриване на вирусна нуклеинова киселина е да се изложи вирусната РНК през клетъчен лизат и след това да се използва флуоресцентна обратна транскрипция-полимеразна верижна реакция (RT-PCR) в реално време за откриване.

Ключът към принципа на откриване е да се използват праймери и сонди за постигане на „насочено съвпадение“ на последователности на нуклеинова киселина, тоест да се намери последователността на нуклеинова киселина на SARS-CoV-2, която е различна от другите вируси в около 30 000 бази (сходството на нуклеиновата киселина с други вируси) „Ниска“ област), проектиране на праймери и сонди.

Праймерите и пробите са силно съвпадащи със специфичния регион на нуклеиновата киселина SARS-CoV-2, тоест специфичността е много силна.След като резултатът от флуоресцентната RT-PCR амплификация в реално време на пробата, която ще се тества, е положителен, това доказва, че SARS-CoV-2 присъства в пробата.Вижте P2.

P2 Етапи на определяне на нуклеинова киселина SARS-CoV-2 (флуоресцентна RT-PCR в реално време)

Условия и изисквания на лабораторията за откриване на нуклеинови киселини на SARS-CoV-2

Лабораториите за тестване на нуклеинови киселини са най-идеалните за среди с отрицателно налягане и те трябва да обърнат внимание на мониторинга на налягането, да поддържат въздушния поток и да елиминират аерозолите.Персоналът за тестване на нуклеинови киселини трябва да има съответните квалификации, да получи подходящо обучение за полимеразна верижна реакция и да премине оценката.Лабораторията трябва да бъде стриктно управлявана, зонирана и влизането на неподходящ персонал е строго забранено.Чистата зона трябва да се проветри и дезинфекцира на място.Съответните елементи се поставят в зони, чистите и мръсните се разделят, подменят се навреме и се обеззаразяват на място.Рутинна дезинфекция: Дезинфектантът, съдържащ хлор, е основното решение за по-големи площи, а за малки площи може да се използва 75% алкохол.Добър начин за справяне с аерозолите е отварянето на прозорци за проветряване, а дезинфекцията на въздуха може да се извърши и чрез ултравиолетови лъчи, филтриране и дезинфекция на въздуха.

Ключови връзки и параметри за определяне на нуклеинова киселина SARS-CoV-2 (флуоресцентна RT-PCR в реално време)

Въпреки че лабораториите обикновено обръщат голямо внимание на „откриването“ на нуклеинова киселина, всъщност „извличането“ на нуклеинова киселина също е една от ключовите стъпки за успешно откриване, което е тясно свързано със събирането и съхранението на вирусни проби.

Понастоящем най-широко използваните респираторни проби, като назофарингеални тампони, използват втория метод, който е инактивиращ (консервиращ) разтвор, приготвен на базата на екстракция на нуклеинова киселина и лизиращ разтвор.От една страна, това решение за запазване на вируса може да денатурира протеина на вируса, да загуби своята активност и вече да не бъде инфекциозен, и да подобри безопасността на етапа на транспортиране и откриване;от друга страна, може директно да разбие вируса, за да освободи нуклеиновата киселина, да елиминира ензима, разлагащ нуклеиновата киселина, и да предотврати вируса.РНК се разгражда.

Разтвор за вземане на вирусни проби, приготвен на базата на лизиращ разтвор за екстракция на нуклеинова киселина.Основните компоненти са балансирани соли, етилендиаминететраоцетно киселинно хелиращ агент, сол от гуанидин (гуанидин изотиоцианат, гуанидин хидрохлорид и др OL, протеиназа К и други няколко или повече компонента.Понастоящем има много видове комплекти за екстракция на нуклеинова киселина и се използват различни реагенти за екстракция и пречистване на нуклеинова киселина.Дори ако се използва един и същ реагент за екстракция и пречистване на нуклеинова киселина, процедурите за екстракция на всеки комплект са различни.

Понастоящем продуктите на комплекта за откриване на нуклеинова киселина, одобрени от Националната администрация за медицински продукти, се избират въз основа на гените ORF1ab, E и N в генома на SARS-CoV-2.Принципите на откриване на различните продукти са основно еднакви, но техните праймери и дизайн на сондата са различни.Има сегменти с една цел (ORF1ab), сегменти с двойна цел (ORF1ab, N или E) и сегменти с три цели (ORF1ab, N и E).Разликата между откриване и интерпретация, екстракция на нуклеинова киселина и флуоресцентна RT-PCR реакционна система в реално време трябва да се отнася до съответните инструкции за комплекта и се препоръчва потребителите да следват стриктно метода за интерпретация, посочен в инструкциите за комплекта за интерпретация.Общите региони, праймери и последователности на проби, амплифицирани чрез флуоресцентна RT-PCR в реално време, са показани в P3.

P3 Местоположението на мишената на ампликона SARS-CoV-2 в генома и последователността на праймерите и сондите

Тълкуване на резултатите от определянето на нуклеинова киселина SARS-CoV-2 (RмногоTиме флуоресцентна RT-PCR)

„План за превенция и контрол на пневмония при инфекция SARS-CoV-2 (второ издание)“ за първи път изясни критериите за преценка на резултатите от амплификация на единичен ген:

1. Няма Ct или Ct≥40 е отрицателен;

2. Ct<37 е положителен;

3. Стойността на Ct от 37-40 е зоната на сивата скала.Препоръчително е експериментът да се повтори.Ако резултатът от повторната обработка на Ct<40 и кривата на усилване има очевидни пикове, пробата се оценява като положителна, в противен случай е отрицателна.

Третото издание на ръководството и четвъртото издание на ръководството продължават горните критерии.Въпреки това, поради различните мишени, използвани в търговските комплекти, гореспоменатото 3-то издание на ръководството не дава критериите за определяне на комбинацията от мишени, като подчертава, че инструкциите, предоставени от производителя, имат предимство.Започвайки от петото издание на насоките, две цели са изяснени, особено критериите за преценка за една цел, която е трудна за преценка.Тоест, ако лабораторията иска да потвърди, че даден случай е положителен за откриване на нуклеинова киселина SARS-CoV-2, трябва да бъде изпълнено следното 1 от 2 условия:

(1) Две мишени на SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) в една и съща проба са тествани положително чрез флуоресцентна RT-PCR в реално време.Ако една цел е положителна, е необходимо повторно вземане на проби и повторно тестване.Ако резултатите от теста са Ако единичната цел все още е положителна, тя се оценява като положителна.

(2) Две проби от флуоресцентна RT-PCR в реално време показаха единичен положителен резултат едновременно или две проби от един и същи тип показаха единичен положителен резултат от теста, който може да се оцени като положителен.Насоките обаче също така подчертават, че отрицателните резултати от теста за нуклеинова киселина не могат да изключат инфекцията със SARS-CoV-2.Трябва да се изключат фактори, които могат да причинят фалшиво отрицателни резултати, включително лошо качество на пробите (респираторни проби от орофаринкса и други части), вземане на проби твърде рано или твърде късно, пробите не са били съхранявани, транспортирани и обработени правилно и самата технология е имала проблеми (вариация на вируса, инхибиране на PCR) и т.н.

Причини за фалшиви отрицателни резултати при откриване на SARS-CoV-2

Концепцията за „фалшиво отрицателен“ при тестване на нуклеинова киселина, която в момента е засегната, често се отнася до „фалшиво отрицателен“, при който резултатите от теста за нуклеинова киселина са несъвместими с клиничните прояви, т.е. клиничните симптоми и резултатите от образната диагностика са много подозрителни за COVID-19, но тестовете за нуклеинова киселина винаги са „отрицателни“ много пъти.Клинично-лабораторният център на Националната здравна комисия обясни „фалшиво отрицателния“ тест за SARS-CoV-2.

(1) В клетките на заразеното лице има известно количество вирус.Съществуващите данни показват, че след като тялото е заразено с вируса, вирусът навлиза в гърлото през носа и устата, след това в трахеята и бронхите и след това достига до алвеолите.Заразеното лице ще преживее инкубационния период, леките симптоми и след това процеса на тежки симптоми и различни етапи на заболяването.И количеството на вируса в различните части на тялото е различно.

По отношение на вирусния товар на клетъчните типове, алвеоларни епителни клетки (долни дихателни пътища)> епителни клетки на дихателните пътища (горни дихателни пътища)> фибробласти, ендотелни клетки и макрофаги и др.;от вида на пробата, течност от алвеоларен лаваж (най-отличната)>храчка при дълбока кашлица>назофарингеален тампон>орофарингеален тампон>кръв.Освен това вирусът може да бъде открит и в изпражненията.Въпреки това, като се има предвид удобството на операцията и приемането на пациентите, често използваният ред на клинични проби е орофарингеален тампон>назофарингеален тампон>бронхиална промивна течност (сложна операция) и дълбока храчка (обикновено суха кашлица, трудна за получаване) .

Следователно количеството на вируса в клетките на орофаринкса или назофаринкса на някои пациенти е малко или изключително ниско.Ако за изследване се вземат само проби от орофаринкса или назофаринкса, вирусната нуклеинова киселина няма да бъде открита.

(2) По време на събирането на пробата не са събрани клетки, съдържащи вирус, или вирусната нуклеинова киселина не е била ефективно запазена.

[① Неподходящо място за вземане, например при събиране на орофарингеални тампони, дълбочината на събиране не е достатъчна, събраните назофарингеални тампони не се събират дълбоко в носната кухина и т.н. Повечето от събраните клетки може да са клетки без вируси;

②Тампоните за вземане на проби са използвани неправилно.Например синтетични влакна като PE влакна, полиестерни влакна и полипропиленови влакна се препоръчват за материала на главата на тампона.Естествени влакна като памук се използват в действителната работа (силна адсорбция на протеини и не е лесно да се измият) и найлонови влакна (лоша абсорбция на вода, което води до недостатъчен обем на вземане на проби);

③Неправилно използване на епруветки за съхранение на вируси, като например злоупотреба с полипропиленови или полиетиленови пластмасови епруветки за съхранение, които лесно абсорбират нуклеинови киселини (ДНК/РНК), което води до намаляване на концентрацията на нуклеинова киселина в разтвора за съхранение.На практика се препоръчва използването на полиетилен-пропиленова полимерна пластмаса и някои специално обработени полипропиленови пластмасови контейнери за съхранение на вирусни нуклеинови киселини.]

[① Неподходящо място за вземане, например при събиране на орофарингеални тампони, дълбочината на събиране не е достатъчна, събраните назофарингеални тампони не се събират дълбоко в носната кухина и т.н. Повечето от събраните клетки може да са клетки без вируси;

②Тампоните за вземане на проби са използвани неправилно.Например синтетични влакна като PE влакна, полиестерни влакна и полипропиленови влакна се препоръчват за материала на главата на тампона.Естествени влакна като памук се използват в действителната работа (силна адсорбция на протеини и не е лесно да се измият) и найлонови влакна (лоша абсорбция на вода, което води до недостатъчен обем на вземане на проби);

③Неправилно използване на епруветки за съхранение на вируси, като например злоупотреба с полипропиленови или полиетиленови пластмасови епруветки за съхранение, които лесно абсорбират нуклеинови киселини (ДНК/РНК), което води до намаляване на концентрацията на нуклеинова киселина в разтвора за съхранение.На практика се препоръчва използването на полиетилен-пропиленова полимерна пластмаса и някои специално обработени полипропиленови пластмасови контейнери за съхранение на вирусни нуклеинови киселини.]

(4) Работата на клиничната лаборатория не е стандартизирана.Условията за транспортиране и съхранение на пробите, стандартизираната работа на клиничните лаборатории, интерпретацията на резултатите и контролът на качеството са ключовите фактори за осигуряване на точността и надеждността на резултатите от теста.Според резултатите от външната оценка на качеството, проведена от Клинично-лабораторния център на НЗОК в периода 16-24 март 2020 г., от 844 лаборатории, получили валидни резултати, 701 (83,1%) са квалифицирани, а 143 (16,9%) не са.Квалифицирани, общите условия за лабораторно изследване са добри, но различните лаборатории все още имат разлики в способността за работа на персонала, способността за интерпретация на положителна проба с една цел и контрола на качеството.

Как да намалим фалшивите отрицателни резултати при откриване на нуклеинова киселина на SARS-CoV-2?

Намаляването на фалшивите отрицателни резултати при откриването на нуклеинова киселина трябва да се оптимизира от четирите аспекта на получаване на фалшиви отрицателни резултати.

(1) В клетките на заразеното лице има известно количество вирус.Концентрацията на вируса в различните части на тялото на предполагаемо заразените лица ще бъде различна по различно време.Ако няма фаринкс, може да е в течност от бронхиален лаваж или изпражнения.Ако няколко вида проби могат да бъдат събрани по едно и също време или на различни етапи от прогресията на заболяването за тестване, това ще помогне да се избегнат фалшиви отрицателни резултати.

(2) Клетките, съдържащи вирус, трябва да бъдат събрани по време на вземането на проба.Този проблем може да бъде решен до голяма степен чрез засилване на обучението на събирачите на проби.

(3) Надеждни IVD реагенти.Чрез извършване на изследвания за оценка на ефективността на откриване на реагенти на национално ниво и обсъждане на съществуващите проблеми, ефективността на откриване на реагентите може да бъде допълнително подобрена и чувствителността на анализа може да бъде подобрена.

(4) Стандартизирана работа на клиничните лаборатории.Чрез засилване на обучението на лабораторния персонал, непрекъснато подобряване на системата за управление на качеството на лабораторията, осигуряване на разумни разделения и подобряване на способността на персонала да открива, е възможно да се намалят фалшивите отрицателни резултати поради неправилни лабораторни операции.

Причини за положителен повторен тест за нуклеинова киселина SARS-CoV-2 при възстановени и изписани пациенти

„Планът за диагностика и лечение на COVID-19 (Пробно седмо издание)“ ясно постановява, че един от критериите за пациентите с COVID-19 да бъдат излекувани и изписани от болницата е две последователни проби от дихателните пътища да имат отрицателен тест за нуклеинова киселина (с интервал от най-малко 24 часа), но има много малко Тестът за нуклеинова киселина SARS-CoV-2 отново е положителен при изписани пациенти поради различни причини.

(1) SARS-CoV-2 е нов вирус.Необходимо е допълнително да се разбере неговият патогенен механизъм, пълната картина на причиненото заболяване и характеристиките на хода на заболяването.Ето защо, от една страна, е необходимо да се засили управлението на изписаните пациенти и да се проведе 14-дневно медицинско наблюдение.Провеждайте проследяване, здравно наблюдение и здравни насоки за задълбочаване на разбирането на целия процес на възникване, развитие и изход от заболяването.

(2) Пациентът може отново да се зарази с вируса.Академик Zhong Nanshan каза: Тъй като излекуваните пациенти имат антитела, SARS-CoV-2 може да бъде елиминиран от антитела, когато нахлуят отново.Има много причини, които могат да бъдат причината за оздравелия пациент или може да са свързани с мутация на вируса или дори причината за лабораторни изследвания.Ако това е самият вирус, мутацията на SARS-CoV-2 може да доведе до неефективност на антитялото, произведено от възстановилия се пациент, срещу мутиралия вирус.Ако пациентът е заразен отново с мутиралия вирус, тестът за нуклеинова киселина може отново да е положителен.

(3) Що се отнася до лабораторните методи за изпитване, всеки метод за изпитване има своите ограничения.Откриването на нуклеинови киселини на SARS-CoV-2 се дължи на избора на генна последователност, състава на реагентите, чувствителността на метода и други причини, които водят до това, че съществуващите комплекти имат свои собствени по-ниски граници на откриване.След като пациентът се лекува, вирусът в тялото намалява.Когато вирусният товар в пробата за изследване е под долната граница на откриване, ще се появи „отрицателен“ резултат.Този резултат обаче не означава, че вирусът в тялото е изчезнал напълно.Вирусът може да е след спиране на лечението.Възраждане”, продължете да копирате.Поради това се препоръчва преглед веднъж седмично в рамките на 2 до 4 седмици след изписването.

(4) Нуклеиновата киселина е генетичният материал на вируса.Вирусът се убива, след като пациентът е преминал антивирусно лечение, но останалите вирусни РНК фрагменти все още се задържат в човешкото тяло и не се изхвърлят напълно от тялото.Понякога, при определени обстоятелства, може да бъде по-задържан.Дълго време и по това време тестът за нуклеинова киселина ще бъде „преходно“ положителен.С удължаване на времето за възстановяване на пациента, след постепенното изчерпване на остатъчните РНК фрагменти в тялото, резултатът от теста за нуклеинова киселина може да стане отрицателен.

(5) Резултатът от теста за нуклеинова киселина на SARS-CoV-2 доказва само наличието или отсъствието на вирусна РНК и не може да докаже активността на вируса и дали вирусът е трансмисивен.Необходимо е да се докаже дали пациент, който отново има положителен тест за нуклеинова киселина, ще стане отново източник на инфекция.Необходимо е да се направи вирусна култура върху клинични проби и да се култивира „жив“ вирус, за да се докаже, че е инфекциозен.

Резюме

В обобщение, фалшивите отрицателни резултати от теста за нуклеинова киселина на SARS-CoV-2, положителни резултати от повторни тестове и други състояния, които не са в съответствие с клиничните прояви, не могат да бъдат напълно избегнати.При действителния скрининг и тестване се препоръчва да се комбинират клинични симптоми, образни изследвания (CT) и експерименти, резултати от лабораторни тестове (тест за нуклеинова киселина + тест за вирус-специфични антитела) за цялостна диагноза, за да се предотврати пропусната диагноза и погрешна диагноза.Ако се установи, че резултатите от теста очевидно не съответстват на клиничните прояви, се препоръчва да се извърши цялостен анализ на цялата тестова връзка (връзки за събиране на проби, циркулация и обработка), за да се изключи ранна инфекция с вируса SARS-CoV-2, рецидивираща инфекция или комбинация с други респираторни вирусни инфекции и т.н. възможно.Ако условията позволяват, се препоръчва да се вземат по-чувствителни проби като храчка или алвеоларен лаваж за повторно изследване.

Свързани продукти:

Комплект за откриване на нуклеинова киселина SARS-CoV-2 (метод на мултиплексна PCR флуоресцентна сонда)