• PCR е метод, използван за амплифициране на ДНК от малко количество ДНК шаблон.RT-PCR използва обратна транскрипция, за да произведе ДНК шаблон от източник на РНК, който след това може да бъде амплифициран.
• PCR и RT-PCR обикновено са крайни реакции, докато qPCR и RT-qPCR използват кинетиката на скоростта на синтез на продукта по време на PCR реакцията, за да определят количествено количеството налична матрица.
• По-нови методи, като дигитален PCR, осигуряват абсолютно количествено определяне на първоначалния ДНК шаблон, докато методи като изотермичен PCR намаляват необходимостта от скъпо оборудване за осигуряване на надеждни резултати.

Полимеразна верижна реакция (PCR) е сравнително проста и широко използвана техника на молекулярната биология за амплифициране и откриване на ДНК и РНК последователности.В сравнение с традиционните методи за ДНК клониране и амплификация, които често отнемат дни, PCR изисква само няколко часа.PCR е силно чувствителен и изисква минимален шаблон за откриване и амплификация на специфични последователности.Основните PCR методи са напреднали още повече от обикновено откриване на ДНК и РНК.По-долу сме предоставили общ преглед на различните PCR методи и реактивите, които предоставяме в Enzo Life Sciences за вашите изследователски нужди.Ние се стремим да помогнем на учените да получат бърз достъп до PCR реактиви, които да използват в следващия си изследователски проект!

PCR

За стандартен PCR всичко, от което се нуждаете, е ДНК полимераза, магнезий, нуклеотиди, праймери, ДНК матрицата, която трябва да бъде амплифицирана, и термоциклер.Механизмът на PCR е толкова прост, колкото и целта му: 1) двойноверижната ДНК (dsDNA) е топлинно денатурирана, 2) праймерите се подравняват към единичните ДНК вериги и 3) праймерите се удължават от ДНК полимераза, което води до две копия на оригинална ДНК верига.Процесът на денатурация, отгряване и удължаване през серия от температури и времена е известен като един цикъл на усилване (фиг. 1).

Всяка стъпка от цикъла трябва да бъде оптимизирана за използвания шаблон и комплект грундове.Този цикъл се повтаря приблизително 20-40 пъти и след това амплифицираният продукт може да бъде анализиран, обикновено чрез агарозен гел (фиг. 2).

Тъй като PCR е високочувствителен метод и са необходими много малки обеми за единични реакции, се препоръчва подготовката на основна смес за няколко реакции.Основният микс трябва да се смеси добре и след това да се раздели на броя на реакциите, като се гарантира, че всяка реакция ще съдържа същото количество ензим, dNTP и праймери.Много доставчици, като Enzo Life Sciences, също предлагат PCR смеси, които вече съдържат всичко освен праймери и ДНК матрица.

Богатите на гуанин/цитозин (GC-богати) региони представляват предизвикателство в стандартните PCR техники.Богатите на GC последователности са по-стабилни от последователностите с по-ниско съдържание на GC.Освен това, богатите на GC последователности са склонни да образуват вторични структури, като например бримки на фиби.В резултат на това богатите на GC двойни вериги са трудни за пълно разделяне по време на фазата на денатурация.Следователно ДНК полимеразата не може безпрепятствено да синтезира новата верига.По-високата температура на денатурация може да подобри това и корекциите към по-висока температура на отгряване и по-кратко време на отгряване могат да предотвратят неспецифичното свързване на GC-богатите праймери.Допълнителни реагенти могат да подобрят амплификацията на богати на GC последователности.DMSO, глицеролът и бетаинът спомагат за разрушаването на вторичните структури, причинени от GC взаимодействия и по този начин улесняват разделянето на двойните вериги.

PCR с горещ старт

Неспецифичната амплификация е проблем, който може да възникне по време на PCR.Повечето ДНК полимерази, които се използват за PCR, работят най-добре при температури около 68°C до 72°C.Ензимът обаче може да бъде активен и при по-ниски температури, макар и в по-ниска степен.При температури далеч под температурата на отгряване, праймерите могат да се свържат неспецифично и да доведат до неспецифично усилване, дори ако реакцията е поставена върху лед.Това може да бъде предотвратено чрез използване на полимеразни инхибитори, които се отделят от ДНК полимеразата само след достигане на определена температура, оттук и терминът PCR с горещ старт.Инхибиторът може да бъде антитяло, което свързва полимеразата и денатурира при първоначалната температура на денатуриране (95°C обикновено).

Висококачествена полимераза

Докато ДНК полимеразите се амплифицират сравнително точно към оригиналната шаблонна последователност, могат да възникнат грешки в нуклеотидното съвпадение.Несъответствията в приложения като клониране могат да доведат до пресечени транскрипти и неправилно транслирани или неактивни протеини надолу по веригата.За да се избегнат тези несъответствия, бяха идентифицирани и включени в работния процес полимерази с „коригираща“ дейност.Първата полимераза за корекция, Pfu, е идентифицирана през 1991 г. в Pyrococcus furiosus.Този Pfu ензим има 3' до 5' екзонуклеазна активност.Тъй като ДНК се амплифицира, екзонуклеазата премахва несъответстващите нуклеотиди в 3' края на веригата.След това правилният нуклеотид се заменя и синтезата на ДНК продължава.Идентифицирането на неправилни нуклеотидни последователности се основава на афинитета на свързване за правилния нуклеозид трифосфат с ензима, където неефективното свързване забавя синтеза и позволява правилното заместване.Коригиращата активност на Pfu полимеразата води до по-малко грешки в крайната последователност в сравнение с Taq ДНК полимеразата.През последните години бяха идентифицирани други ензими за корекция и бяха направени модификации на оригиналния Pfu ензим, за да се намали допълнително степента на грешка по време на амплификация на ДНК.

RT-PCR

PCR с обратна транскрипция или RT-PCR позволява използването на РНК като шаблон.Допълнителна стъпка позволява откриването и амплификацията на РНК.РНК се транскрибира обратно в комплементарна ДНК (cDNA), като се използва обратна транскриптаза.Качеството и чистотата на матрицата на РНК са от съществено значение за успеха на RT-PCR.Първата стъпка на RT-PCR е синтеза на ДНК/РНК хибрид.Обратната транскриптаза също има функция на РНКаза Н, която разгражда РНК частта на хибрида.След това едноверижната ДНК молекула се допълва от ДНК-зависимата ДНК полимеразна активност на обратната транскриптаза в сДНК.Ефективността на реакцията на първата верига може да повлияе на процеса на усилване.От тук нататък стандартната PCR процедура се използва за амплифициране на cDNA.Възможността за връщане на РНК в сДНК чрез RT-PCR има много предимства и се използва предимно за анализ на генна експресия.РНК е едноверижна и много нестабилна, което прави работата с нея трудна.Обикновено служи като първа стъпка в qPCR, която определя количествено РНК транскриптите в биологична проба.

qPCR и RT-qPCR

Количественият PCR (qPCR) се използва за откриване, характеризиране и количествено определяне на нуклеинови киселини за множество приложения.В RT-qPCR, РНК транскриптите често се определят количествено чрез обратното им транскрибиране първо в cDNA, както е описано по-горе, и след това впоследствие се извършва qPCR.Както при стандартната PCR, ДНК се амплифицира чрез три повтарящи се стъпки: денатурация, отгряване и удължаване.При qPCR обаче флуоресцентното маркиране позволява събирането на данни с напредването на PCR.Тази техника има много предимства поради гамата от налични методи и химикали.

В базираната на багрило qPCR (обикновено зелена) флуоресцентното маркиране позволява количественото определяне на амплифицираните ДНК молекули чрез използване на dsDNA свързващо багрило.По време на всеки цикъл се измерва флуоресценцията.Флуоресцентният сигнал се увеличава пропорционално на количеството репликирана ДНК.Следователно, ДНК се определя количествено в „реално време“ (фиг. 3).Недостатъците на базираната на багрило qPCR са, че само една мишена може да бъде изследвана наведнъж и че багрилото ще се свърже с всяка ds-ДНК, присъстваща в пробата.

При qPCR, базиран на сонда, много мишени могат да бъдат открити едновременно във всяка проба, но това изисква оптимизиране и проектиране на специфична за целта сонда(и), използвана в допълнение към праймерите.Налични са няколко вида конструкции на сонди, но най-често срещаният тип е сонда за хидролиза, която включва флуорофор и гасител.Преносът на флуоресцентна резонансна енергия (FRET) предотвратява излъчването на флуорофора през гасителя, докато сондата е непокътната.Въпреки това, по време на PCR реакцията, сондата се хидролизира по време на удължаване на праймера и амплификация на специфичната последователност, към която е свързана.Разцепването на сондата разделя флуорофора от гасителя и води до зависимо от амплификацията увеличение на флуоресценцията (фиг. 4).По този начин флуоресцентният сигнал от базирана на проба qPCR реакция е пропорционален на количеството на целевата последователност на пробата, присъстваща в пробата.Тъй като базираната на сонда qPCR е по-специфична от базираната на багрило qPCR, това често е технологията, използвана в базираните на qPCR диагностични анализи.

Изотермично усилване

Споменатите по-горе PCR техники изискват скъпо оборудване за термоциклиране за точно повишаване и понижаване на температурите в камерата за етапите на денатуриране, отгряване и удължаване.Разработени са редица техники, които не се нуждаят от толкова прецизни устройства и могат да се изпълняват на обикновена водна баня или дори в интересуващите ни клетки.Тези техники се наричат ​​заедно изотермично усилване и работят на базата на експоненциално, линейно или каскадно усилване.

Най-известният тип изотермично усилване е изотермично усилване, медиирано от верига, или LAMP.LAMP използва експоненциално усилване при 65⁰C за усилване на шаблонна ДНК или РНК.При извършване на LAMP се използват четири до шест праймера, комплементарни на региони от целевата ДНК, с ДНК полимераза за синтезиране на нова ДНК.Два от тези праймери имат допълващи се последователности, които разпознават последователности в другите праймери и ги свързват, позволявайки образуването на „примкова“ структура в новосинтезираната ДНК, която след това подпомага отгряването на праймера в следващите кръгове на амплификация.LAMP може да се визуализира чрез множество методи, включително флуоресценция, електрофореза в агарозен гел или колориметрия.Лесното визуализиране и откриване на наличието или отсъствието на продукт чрез колориметрия и липсата на необходимо скъпо оборудване направиха LAMP подходящ вариант за тестване на SARS-CoV-2 в райони, където клиничните лабораторни тестове не бяха лесно достъпни, или съхранение и транспортиране на проби не е било осъществимо или в лаборатории, които преди това не са разполагали с оборудване за PCR термоциклиране.