Ⅰ. Увеличете чувствителността на реакционната система:

1. Отделете висококачествена РНК:

Успешният синтез на кДНК идва от висококачествена РНК.Висококачествената РНК трябва да осигури поне общо по-дълго и да не съдържа инхибитори, които не съдържат записващи ензими, като EDTA или SDS.Качеството на РНК определя максималната стойност на информацията за последователността, която можете да транскрибирате в кДНК.Общият метод за пречистване на РНК е стъпков метод за използване на изооцианат/ацидофенол.За да се предотврати замърсяването на РНКаза, РНК, отделена от проба, богата на РНКаза (като панкреас), изисква съхранение на формалдехид, за да се запази висококачествена РНК, което е още повече за дългосрочно съхранение.РНК, извлечена от черния дроб на плъх, основно се разгражда след една седмица съхранение във вода, докато РНК, извлечена от далака на плъх, остава стабилна след три години съхранение във вода.В допълнение, транскриптите, по-големи от 4 kb, са по-чувствителни към проследяване на разграждането на РНКаза, отколкото малките транскрипти.За да се увеличи стабилността на пробата РНК за съхранение, РНК може да се разтвори в метален йон и да се съхранява при -70 °C.Тилидът, използван за запазване на РНК, не трябва да съдържа различни обекти, които разграждат РНК.РНК, която се извлича от панкреаса, може да се съхранява в металмамин поне една година.Когато сте готови да използвате РНК, можете да използвате следните методи за утаяване на РНК: добавете NaCl до 0,2 m и 4 пъти обема етанол, поставете на стайна температура за 3-5 минути и 10 000 × g центрофугирайте за 5 минути.

2. Използвайте обратна транскриптаза без активност на RNaseH (RNaseH-):

Инхибиторите на RNase често се добавят към реакциите на обратна транскрипция, за да се увеличи дължината и добива на cDNA синтеза.РНКазен инхибитор се добавя в първата верижна синтезна реакция в присъствието на буфери и редуциращи агенти като DTT, тъй като процесът на синтез на преди кДНК денатурира инхибитора, като по този начин освобождава свързани РНКази, които разграждат РНК.Инхибиторът на протеиновата РНКаза предотвратява само разграждането на РНК от РНКаза A, B, C и не предотвратява РНКазите върху кожата, така че трябва да се внимава да не се въвеждат РНКази от пръстите въпреки употребата на тези инхибитори.

Обратната транскриптаза катализира превръщането на РНК в сДНК.Както M-MLV, така и AMV имат ендогенна RNaseH активност в допълнение към тяхната собствена полимеразна активност.Активността на RNaseH се конкурира с активността на полимераза за хетерозиготни вериги, образувани между РНК шаблони и ДНК праймери или сДНК удължителни вериги, и разгражда РНК: РНК вериги в ДНК комплекси.RNA шаблони, разградени от активността на RNaseH, вече не могат да се използват като ефективни субстрати за cDNA синтез, намалявайки добива и продължителността на cDNA синтеза.По този начин елиминирането или силното намаляване на активността на RNaseH на обратната транскриптаза би било от голяма полза.

SuperScriptⅡ обратна транскриптаза, MMLV обратна транскриптаза на RNaseH- и thermoScript обратна транскриптаза, AMV на RNaseH- дават повече сДНК с пълна дължина от MMLV и AMV.RT-PCR чувствителността се влияе от количеството синтезирана cDNA.ThermoScript е много по-чувствителен от AMV.Размерът на RT-PCR продуктите е ограничен от способността на обратната транскриптаза да синтезира cDNA, особено когато се клонират по-големи Cdnas.В сравнение с MMLV, SuperScripⅡ значително увеличи добива на дълги RT-PCR продукти.Обратната транскриптаза на RNaseH- също повишава термичната стабилност, така че реакцията може да се проведе при температури, по-високи от нормалните от 37-42 ℃.При предложените условия на синтез бяха използвани олиго(dT) праймери и 10μCi [alpha-p]dCTP.Общото производство на първата верига беше изчислено с помощта на метода на утаяване на TCA.СДНК с пълна дължина се анализира, като се използва отстраняване на сортирани по размер ленти и преброяване в алкален агарозен гел.

3. Увеличете температурата на запазване на топлината на обратната транскрипция:

По-високата температура на задържане помага да се отвори вторичната структура на РНК и да се увеличи добивът на реакцията.За повечето РНК шаблони задържането на РНК и праймера при 65°C без буфер или сол и след това бързото им охлаждане върху лед елиминира повечето вторични структури и позволява на праймерите да се свържат.Въпреки това, някои шаблони все още имат вторична структура, дори след термична денатурация.Амплификацията на тези трудни шаблони може да се извърши с помощта на ThermoScript обратна транскриптаза и чрез поставяне на реакцията на обратната транскриптаза при по-високи температури за подобряване на амплификацията.По-високите температури на задържане също могат да повишат специфичността, особено когато синтезът на cDNA се извършва с помощта на генно-специфични праймери (GSPS) (вижте глава 3).Ако използвате GSP, уверете се, че стойността на Tm на грунда е същата като очакваната температура на задържане.Не използвайте олиго(dT) и произволни праймери над 60 ℃.Случайните праймери трябва да се държат при 25 ℃ за 10 минути, преди да се повиши до 60 ℃.В допълнение към използването на по-високи температури на обратна транскрипция, специфичността може да бъде подобрена чрез директно прехвърляне на сместа РНК/праймер от температурата на денатуриране 65 ℃ към температурата на задържане на обратната транскрипция и добавяне на предварително загрята 2 × реакционна смес (синтез на термично иницииране на кДНК).Този подход помага да се предотврати междумолекулното сдвояване на основите, което се случва при по-ниски температури.Използването на PCR инструмент опростява много температурни превключватели, необходими за RT-PCR.

Tth термостабилизираната полимераза действа като ДНК полимераза в присъствието на Mg2+ и РНК полимераза в присъствието на Mn2+.Може да поддържа топлина до 65 ℃.Въпреки това, присъствието на Mn2+ по време на PCR намалява прецизността, което прави Tth полимеразата по-малко подходяща за високопрецизна амплификация, като например cDNA клониране.В допълнение, Tth е по-малко ефективен при обратна транскрипция, което намалява чувствителността, и тъй като един ензим може да извърши обратна транскрипция и PCR, контролните реакции без обратна транскрипция не могат да бъдат използвани за разграничаване на амплифицирани продукти на cDNA от тези на замърсена геномна ДНК.

4. Добавка, която насърчава обратната транскрипция:

Добавянето на добавки, включително глицерин и DMSO, към реакцията на синтез на първата верига може да намали стабилността на двойната верига на нуклеиновата киселина и да развие вторичната структура на РНК.Могат да се добавят до 20% глицерин или 10% DMSO, без да се засяга активността на SuperScriptⅡ или MMLV.AMV може също така да понася до 20% глицерол, без да намалява активността.За да се увеличи максимално чувствителността на RT-PCR в SuperScriptⅡ реакция на обратна транскрипция, може да се добави 10% глицерол и да се изолира при 45 ℃.Ако 1/10 от продукта на реакцията на ретротранскрипция се добави към PCR, концентрацията на глицерол в реакцията на амплификация е 0,4%, което не е достатъчно, за да инхибира PCR.

5. Обработка на RNaseH:

Чувствителността може да бъде подобрена чрез третиране на реакциите на синтез на cDNA с RNaseH преди PCR.За някои матрици се смята, че РНК в реакцията на синтез на кДНК предотвратява свързването на амплифицирани продукти, в който случай лечението с RNaseH може да повиши чувствителността.Като цяло, лечението с RNaseH е необходимо за амплификация на относително дълъг сДНК целеви шаблон с пълна дължина, като туберозна схерозаⅡ с ниско копие.За този труден шаблон, RNaseH усилва сигнала, генериран от cDNA, синтезирана от SuperScriptⅡ или AMV.За повечето RT-PCR реакции лечението с RNaseH не е задължително, тъй като стъпката на денатуриране при 95 ℃ изолирана PCR обикновено хидролизира РНК от комплекса РНК: ДНК.

6. Подобрени методи за откриване на малки количества РНК:

RT-PCR е особено предизвикателство, когато са налични само малки количества РНК.Добавянето на гликоген като носител по време на разделянето на РНК спомага за увеличаване на добива на малки проби.Гликоген без РНКаза може да се добави едновременно с Trizol.Гликогенът е водоразтворим и може да остане във водната фаза с РНК, за да подпомогне последващото утаяване.Препоръчителната концентрация на гликоген без РНКаза е 250 μg/ml за проби по-малко от 50 mg тъкан или 106 култивирани клетки.

Добавянето на ацетилиран BSA към реакции на обратна транскрипция с помощта на SuperScriptⅡ може да увеличи чувствителността, а за малки количества РНК, намаляването на количеството SuperScriptⅡ и добавянето на 40 единици нуклеазен инхибитор на RnaseOut може да подобри нивото на откриване.Ако се използва гликоген при разделянето на РНК, все още се препоръчва добавянето на инхибитори на BSA или RNase за реакции на обратна транскрипция с помощта на SuperScriptⅡ.

Ⅱ. Увеличете специфичността на RT-PCR

1. cNDA синтез:

Могат да се използват три различни метода за иницииране на синтеза на първата верига на кДНК и относителната специфичност на всеки метод засяга количеството и вида на синтезираната сДНК.

Методът на случаен праймер е най-малко специфичният от трите метода.Праймерите се отгряват на множество места в целия транскрипт, за да се получи къса сДНК с частична дължина.Този метод често се използва за получаване на 5' крайни последователности и сДНК от РНК шаблони с вторични структурни области или с терминиращи места, които обратната транскриптаза не може да репликира.За да се получи най-дългата сДНК, съотношението на праймерите към РНК във всяка РНК проба трябва да се определи емпирично.Първоначалната концентрация на произволни праймери варира от 50 до 250 ng на 20 μl реакционна система.Тъй като сДНК, синтезирана от обща РНК с помощта на случайни праймери, е главно рибозомна РНК, поли(А)+РНК обикновено се избира като шаблон.

Oligo(dT) инициирането е по-специфично от произволните праймери.Той хибридизира с поли(А) опашката, открита в 3' края на иРНК в повечето еукариотни клетки.Тъй като поли(А)+РНК е приблизително 1% до 2% от общата РНК, количеството и сложността на сДНК е много по-малко, отколкото ако се използват произволни праймери.Поради високата си специфичност, олиго(dT) обикновено не изисква оптимизиране за съотношението РНК към праймер и поли(А)+ селекция.Препоръчва се използването на 0,5 μg олиго(dT) на 20 μl реакционна система.oligo(dT)12-18 е подходящ за повечето RT-PCR.Системата ThermoScript RT-PCR осигурява олиго(dT)20 поради добрата си термична стабилност и е подходяща за по-високи температури на задържане.

Ген-специфичните праймери (GSP) са най-добрите специфични праймери за стъпката на обратна транскрипция.GSP е антисенс олигонуклеозид, който може специфично да хибридизира с последователности на дестинация на РНК, вместо да свързва всички РНК като произволни праймери или олиго(dT).Правилата, използвани за проектиране на PCR праймери, се прилагат и за дизайна на реакцията на обратна транскрипция GSP.GSP може да бъде същата последователност като амплификационния праймер, закален в края на mRNA3', или GSP може да бъде проектиран да бъде закален надолу по веригата с праймера за обратно усилване.За някои амплифицирани обекти е необходимо да се проектира повече от един антисенс праймер за успешна RT-PCR, тъй като вторичната структура на таргетната РНК може да попречи на праймера да се свърже.Предлага се да се използва 1 pmol антисенс GSP в първата система за реакция на верижен синтез от 20 μl.

2. Увеличете температурата на запазване на топлината на обратната транскрипция:

За да се възползвате напълно от спецификата на GSP, трябва да се използва обратна транскриптаза с висока термична стабилност.Термостабилната обратна транскриптаза може да бъде изолирана при по-високи температури, за да се увеличи строгостта на реакцията.Например, ако GSP се закали при 55°C, тогава спецификата на GSP не се използва напълно, ако обратната транскрипция се извърши при 37°C с ниска строгост, като се използва AMV или M-MLV.Въпреки това, SuperScripⅡ и ThermoScript могат да реагират при 50 ℃ или по-висока, което елиминира неспецифичните продукти, произведени при по-ниски температури.За максимална специфичност сместа РНК/праймер може да се прехвърли директно от температурата на денатурация 65 ℃ до температурата на задържане на обратната транскрипция с добавяне на предварително загрята 2 х реакционна смес (термично иницииране на синтеза на кДНК).Това помага да се предотврати сдвояването на основите между молекулите при ниски температури.Използването на PCR инструмент опростява многото температурни преходи, необходими за RT-PCR.

3. Намаляване на замърсяването с геномна ДНК:

Една потенциална трудност с RT-PCR е, че РНК замърсява геномната ДНК.Използването на по-добри методи за разделяне на РНК, като Trizol Reagent, намалява замърсяването на геномна ДНК в препаратите на РНК.За да се избегнат продукти, произведени от геномна ДНК, РНК може да се третира с Dnas Ⅰ с степен на амплификация, за да се отстрани замърсената ДНК преди обратната транскрипция.Пробите се държат при 65 ℃ в 2,0 mM EDTA за 10 минути, за да се прекрати разграждането на DNaseⅠ.EDTA хелатира магнезиевите йони, за да предотврати зависимата от магнезиевите йони РНК хидролиза, която се случва при високи температури.

За да се отдели амплифицирана сДНК от продукта за амплификация на геномна ДНК, могат да бъдат проектирани праймери, които се отгряват отделно с отделения екзон.PCR продуктите, получени от cDNA, ще бъдат по-къси от тези, получени от замърсена геномна ДНК.Контролиран експеримент без обратна транскрипция също се извършва върху всяка РНК матрица, за да се определи дали даден фрагмент е от геномна ДНК или сДНК.PCR продуктите, получени в отсъствието на обратна транскрипция, се извличат от генома.

Свързан продукт

RT-PCR Лесно^ᵀᴹаз (една стъпка)

- Комплектът в една стъпка позволява извършването на обратна транскрипция и PCR в една и съща епруветка.Трябва само да добави шаблонна РНК, специфични PCR праймери и ddH без РНКаза₂O.

-Количественият анализ на РНК в реално време може да се извърши бързо и точно.

-Комплектът използва уникален реагент за обратна транскрипция на Foregene и ДНК полимераза Foregene HotStar Taq, комбинирани с уникална реакционна система за ефективно подобряване на ефективността на амплификацията и специфичността на реакцията.

- Оптимизираната реакционна система прави реакцията да има по-висока чувствителност на откриване, по-силна термична стабилност и по-добра толерантност.

RT Easy II (с GDNase) Главен премикс за CDNA синтез на първа верига за PCR в реално време с GDNase

-Ефективна способност за премахване на gDNA, която може да премахне gDNA в шаблона в рамките на 2 минути.

-Ефективна система за обратна транскрипция, отнема само 15 минути за завършване на синтеза на първата верига cDNA.

-Комплексни шаблони: шаблони с високо GC съдържание и сложна вторична структура също могат да бъдат обърнати с висока ефективност.

-Високочувствителна система за обратна транскрипция, шаблони на ниво pg също могат да получат висококачествена cDNA.

- Системата за обратна транскрипция има висока термична стабилност, оптималната реакционна температура е 42 ℃ и все още има добра производителност на обратна транскрипция при 50 ℃.