PCR, многократни PCR, PCR in situ, Обратен PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Ще подредим концепциите, стъпките и подробностите за различните PCR

Ⅰ. PCR

Полимеразната верижна реакция, наричана PCR, е молекулярна биологична технология, която се използва за уголемяване на специфични ДНК фрагменти.Може да се разглежда като специална репликация на ДНК in vitro.ДНК полимераза (ДНК полимераза I) е открита още през 1955 г., а фрагментът на Klenow от E. Coli, който има експериментална стойност и практичност, е открит от д-р H. Klenow в началото на 1970 г., но тъй като този ензим не понася температура, високата температура може да го дегенерира, така че не отговаря на полимеразната верижна реакция с дегенерация при висока температура.Ензимите, които се използват днес (наречени Taq полимераза), са изолирани от Thermus aquaticus, бактерия от горещ извор през 1976 г. Характеристиката му е, че може да издържа на висока температура и е идеален ензим, но се използва широко след 80-те години на миналия век.Оригиналната концепция на оригиналния примитивен прототип на PCR е подобна на възстановяването и копирането на гени, което беше предложено от д-р KJell Kleppe през 1971 г. Той публикува първото просто и краткотрайно генно копие (подобно на първите два цикъла реакции на PCR).Разработената днес PCR е разработена от д-р Кари Б. Мълис през 1983 г. През тази година д-р Мълис обслужва PE компании, така че PE има специален статут в PCR индустрията.Д-р Мулис официално публикува първата свързана статия със Сайки и други през 1985 г. Оттогава използването на PCR е хиляди мили на ден и може да се каже, че качеството на свързаните статии прави много други изследователски методи неприятни.Впоследствие PCR технологията се използва широко в биологични научни изследвания и клинични приложения, превръщайки се в най-важната технология за изследване на молекулярната биология.Мълис също печели Нобелова награда за химия през 1993 г.

PCRПринцип

Основният принцип на PCR технологията е подобен на естествения процес на репликация на ДНК и неговата специфичност зависи от олигонуклеотидния праймер, който е комплементарен към двата края на целевата последователност.PCR се състои от три основни етапа на реакция на дегенерация-отгряване-удължаване: ①Дегенерация на шаблонна ДНК: След като шаблонната ДНК се нагрее до около 93°C за определен период от време, разтворът с двойна ДНК за двуверижната ДНК, образуван от PCR амплификацията на матричната ДНК, напуска, го прави единична верига, така че да може да се комбинира с праймера, за да се подготви за следващата кръгова реакция.②Отгряването (съединение) на матричната ДНК и праймера: След като матричната ДНК се нагрее и дегенерира в единична верига, температурата пада до около 55°C.Комплементарната последователност на праймера и матричната ДНК едноверижна.③Разширението на праймера: ДНК матрица - свързването на праймера се основава на действието на TaqDNA полимераза, с dNTP като реакционна суровина.Запазете принципа на репликация, синтезирайте нова полузапазена верига за копиране, която допълва шаблонната ДНК верига, и повторете цикъла дегенерация-отгряване-удължаване на три процеса, можете да получите повече „полузапазена верига за копиране“ и тази нова верига е налична отново. Станете шаблон за следващия цикъл.Отнема 2-4 минути за завършване на цикъла, целевият ген може да бъде амплифициран няколко милиона пъти за 2-3 часа.

СтандартенPCRРеакционна система

Пет елемента на PCR реакцията

Има основно пет вида вещества, участващи в PCR реакцията, а именно праймер, ензим, dNTP, шаблон и буфер (необходим е Mg2+).[PCR процедура]

Стандартният PCR процес е разделен на три стъпки

1. Дегенерация на ДНК (90°C-96°C): Двуверижни ДНК шаблони при термично действие, водородните връзки се разкъсват, образувайки едноверижна ДНК.

2. Отгряване (25 ℃ -65 ℃): Температурата на системата се намалява, праймерът се комбинира с ДНК шаблона, за да се образува локална двойна верига.

3. Удължаване (70℃ -75℃): Под действието на ензима Taq (около 72°C, най-добрата активност), dNTP се използва като суровина, простира се от 5' края на праймера → 3' края, синтезът и шаблонът се допълват една друга ДНК верига.

Всеки цикъл се денатурира, отгрява и удължава, удвоявайки съдържанието на ДНК.Понастоящем, поради късата област на амплификация, някои PCR могат да бъдат репликирани за много кратко време, дори ако активността на ензима Taq не е оптимална, така че може да се промени на две стъпки, тоест отгряването и удължаването могат да се извършват при 60°C-65°C едновременно.За да се намали процесът на повдигане и охлаждане и да се подобри скоростта на реакция.

Характеристики на PCR реакция

● Висока специфичност

Специфичните решаващи фактори за PCR отговора са: ①Специфичната комбинация от праймер и матрична ДНК.②Принципът на базовото сдвояване.③Лоялността на реакцията на синтез на TaqDNA полимераза.④Специфичността и консервативността на целевия ген.

Правилната комбинация от праймери и шаблони е ключът.Свързването на праймера и шаблона и удължаването на веригата на праймера се основават на принципа на съвпадение на алкална основа.Лоялността на реакциите на синтез на полимераза и устойчивостта на висока температура на Taq ДНК полимеразата, за да се направи свързването (съединението) на матрицата и праймера в реакцията може да се извърши при по-висока температура.Специфичността на комбинацията се увеличава значително.Клипът може да поддържа висока степен на коректност.Чрез избор на целеви генетичен регион с висока консервативност и висока консервативност, неговата специфичност е по-висока.

● Висока чувствителност

Обемът на производство на PCR продукти се увеличава с индекс, който може да разшири началния шаблон на Picker (PG=10-12), за да повиши нивото на микроконтролера до нивото на микрограма (μg= -6).Прицелните клетки могат да бъдат открити от 1 милион клетки;при откриване на вируси, чувствителността на PCR може да достигне 3 RFU (празни петна, образувани единици);минималната степен на откриване в бактериалната наука е 3 бактерии.

● Просто и бързо

PCR отражението използва високотемпературна Taq ДНК полимераза, която добавя реакционния разтвор наведнъж, т.е. реакция на дегенерация-отгряване-удължаване на разтвора за амплификация на ДНК и съда на водна баня.Обикновено реакцията на амплификация завършва за 2 до 4 часа.Разширените продукти обикновено се анализират с електрически меч и не трябва да използват изотопи, без радиоактивно замърсяване и лесно промоциране.

● Чистотата на пробата е ниска

Не е необходимо да се разделят вирусите или бактериите и култивираните клетки.Суровите ДНК продукти и РНК могат да се използват като усилватели.Откриването на ДНК амплификация може да се използва директно с помощта на клинични проби като кръв, телесна течност, течност за измиване на кашлицата, коса, клетки и жива тъкан.

PCRобщи проблеми

● Фалшиво отрицателен, без усилени ленти

Ключовите етапи на PCR реакцията включват: ① подготовка на шаблонни нуклеинови киселини, ② качество и специфичност на праймерите, ③ качество на ензимите ④ условия на PCR цикъла.Намирането на причината също трябва да бъде анализирано и проучено за горните връзки.

Шаблони: ① Шаблонът съдържа различни протеини, ② Шаблонът съдържа Taq ензимен инхибитор, ③ Протеинът в шаблона не е елиминиран, особено груповият протеин в хромозомата.⑤ Дегенерацията на нуклеиновата киселина на Deminer не е задълбочена.Когато качеството на ензимите и праймерите е добро, няма лента на усилване, което най-вероятно е храносмилателната обработка на пробите.Има нещо нередно в процеса на екстракция на нуклеинова киселина в шаблона, така че за да се подготви ефективен и стабилен разтвор за смилане, процедурата му трябва да бъде фиксирана, а не произволно променяна.

Инактивиране на ензима: трябва да се използват заедно нов ензим или стари и нови ензими, за да се анализира дали ензимната активност е загубена или недостатъчна, което води до фалшиво отрицателни резултати.Трябва да се отбележи, че ензимът Taq или етидиевият бромид понякога се забравят.

Праймер: качеството на праймера, концентрацията на праймера и дали концентрацията на двата праймера е симетрична.Това е често срещана причина за неуспех на PCR или нарастващата лента не е идеална и склонна към дифузия.Има проблеми с качеството на грундовете на някои партидни номера.Двата праймера имат висока концентрация и ниска концентрация, причинявайки нискоефективно асиметрично усилване.Мерките за противодействие са: ① Изберете добър праймер за синтезиране на единици.② Концентрацията на праймера зависи не само от стойността на OD, но също така обръща внимание на оригиналната течност на праймера, за да се направи електрофореза на агар захарен гел.Трябва да има зона за ленти за праймер и яркостта на двата праймера като цяло трябва да е еднаква.Belt, PCR може да се провали в този момент и трябва да бъде решен с модула за синтез на праймер.Ако праймерът е висок, яркостта е ниска и концентрацията му трябва да бъде балансирана при разреждане.③ Грундът трябва да се плаща и съхранява при висока концентрация, за да се предотврати многократно замразяване или дългосрочно охлаждане на части на хладилника, което ще доведе до влошаване и разграждане на грунда.④ Дизайнът на праймера е неразумен, като например дължината на праймера е недостатъчна и между праймерите се образува ди клъстер.

Концентрация на Mg2+: Концентрацията на Mg2+йони има голямо влияние върху ефективността на PCR амплификация.Прекомерната концентрация може да намали противоположния пол на PCR амплификация.Ако концентрацията е твърде ниска, изходът на PCR амплификация дори ще доведе до неуспех на PCR амплификацията без разширителната лента.

Промяна на реакционния обем: Обемът, използван при PCR амплификация, е 20 ul, 30 ul и 50 ul или 100 uL, големият обем на приложението за PCR амплификация се задава според различни цели на научни изследвания и клинични тестове.След като направите малки обеми като 20 ul, е необходимо да направите състояние на кабела, когато правите размера, в противен случай ще се провали.

Физически причини: Трансформацията е много важна за PCR амплификацията.Ако температурата на дегенерация е ниска, времето за дегенерация е кратко, има вероятност да се случи при фалшиви отрицания;твърде ниската температура на отгряване може да причини неспецифично усилване и да намали ефективността на специфичното усилване.Влияе силно на комбинацията от праймери и шаблони за намаляване на ефективността на PCR амплификация.Понякога е необходимо да се използват стандартни термометри за откриване на променливостта, отгряването и удължената температура в разширението или водоразтворимата готварска печка, което е една от причините за неуспеха на PCR.

Варианти на таргетната последователност: Ако възникне таргетната последователност, мутация или делеция, комбинацията от прототипа и шаблона се комбинира, или поради липса на целева последователност, праймерът и шаблонът ще загубят комплементарната последователност и нейната PCR амплификация няма да бъде успешна.

● Фалшиво положително

Лентата на PCR амплификация изглежда в съответствие с лентата на целевата последователност и понякога нейната лента е по-чиста и по-висока.

Дизайнът на праймера не е подходящ: избраната амплификационна последователност и нецелевата амплификационна последователност са хомоложни, така че при PCR амплификация амплифицираните PCR продукти са нецеленасочени последователности.Целевата последователност е твърде къса или праймерът е твърде къс и е предразположен към фалшиви положителни резултати.Трябва да се преработи.

Кръстосано замърсяване на целева последователност или продукти на амплификация: Има две причини за това замърсяване: Първо, кръстосано замърсяване на целия геном или големи сегменти, което води до фалшиви положителни резултати.Този вид фалшиви положителни резултати могат да бъдат разрешени чрез следните методи: Бъдете внимателни и нежни по време на работа, за да предотвратите вдишване на целевата последователност в пистолета за проби или изпръскване от центробежната тръба.С изключение на ензими и вещества, които не могат да издържат на високи температури, всички реактиви или оборудване трябва да се дезинфекцират с високо налягане.Центробежните тръби и пробите трябва да се използват наведнъж.Когато е необходимо, преди добавяне на проби, реакционната епруветка и реагентът се излагат на ултравиолетови лъчи, за да се унищожи съществуващата нуклеинова киселина.Второ, малки частици в замърсяването на въздуха.Тези малки фрагменти са по-къси от целевата последователност, но имат известна хомология.Може да се съединяват един с друг.След допълване на праймерите, PCR продуктът може да бъде разширен, което ще причини фалшиво положително производство.Може да се използва за намаляване или премахване на PCR метода на гнездото.

● Появява се неспецифична лента на усилване

Лентите, които се появяват след PCR амплификацията, не са в съответствие с очаквания размер, или са големи или малки, или по едно и също време, или по едно и също време, специфични ленти на амплификация и неспецифични ленти на амплификация.Появата на неспецифични ивици е: Първо, праймерите са непълни комплементарни на целевата последователност или полимеризацията на праймера за образуване на ди клъстер.Второто е, че концентрацията на MG2+ йони е твърде висока, температурата на отгряване е твърде ниска и броят на PCR циклите е свързан.Второ, качеството и количеството на ензимите.Често ензимите от някои източници са склонни към неспециални ивици, а ензимите от другия източник не се срещат.Понякога се наблюдава и неспецифично усилване на ензимите.Мерките за противодействие са: преработени атрактивни, ако е необходимо.Намалете количеството ензим или заменете ензима от друг източник.Намалете количеството първични, увеличете съответно количеството шаблони и намалете броя на циклите.Увеличете правилно температурата на отгряване или използвайте метода на двете температурни точки (93°C дегенерация, отгряване и удължаване при около 65°C).

● Появяват се люспести кълчища или петна

PCR амплификацията понякога изглежда като приложена или черупчеста или подобна на килим колан.Поради това, поради прекомерното количество ензими или лошото качество на ензима, концентрацията на dNTP е твърде висока, концентрацията на Mg2+ е твърде висока, температурата на отгряване е твърде ниска и броят на циклите е твърде голям.Контрамерките са: ①Намалете количеството ензими или сменете ензима от друг източник.②Намалете концентрацията на dNTP ③Правилно намалете концентрацията на Mg2+.④Увеличете количеството на шаблоните и намалете броя на циклите.

Свързани продукти

PCR Heroᵀᴹ (с багрило)

◮ По-висока точност: 6 пъти по-висока от тази на обикновения Taq ензим;

◮ По-бърза скорост на усилване

◮ Повече адаптивност на шаблона

◮ По-висока ефективност на усилване

◮ Толерантността към околната среда е по-силна: поставен при 37°C за една седмица, поддържайки повече от 90% активност;

◮ Има 5'→3' ДНК полимеразна активност и 5'→3' екзонуклеазна активност, без 3'→5' екзонуклеазна активност.

PCR Easyᵀᴹ (с боя)

Уникалната реакционна система и високоефективната Taq ДНК полимераза правят PCR реакцията с по-висока ефективност на амплификация, специфичност и чувствителност.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (една стъпка)-SYBR Green I

◮ Комплектът в една стъпка прави обратна транскрипция и qPCR две реакции в една и съща епруветка, трябва само да добавите шаблонна РНК, специфични PCR праймери и ddH без РНКаза₂O.

◮ Комплектът може бързо и ефективно да анализира количествено вирусна РНК или следи от РНК.

◮ Комплектът използва уникален реагент за обратна транскрипция на Foregene и ДНК полимераза Foregene HotStar Taq, комбинирани с уникална реакционна система за ефективно подобряване на ефективността на амплификацията и специфичността на реакцията.

◮ Оптимизираната реакционна система прави реакцията да има по-висока чувствителност на откриване, по-силна термична стабилност и по-добра толерантност.

◮ RT-qPCR Лесно^TM(One Step)-SYBR Green I комплект се доставя с вътрешно референтно багрило ROX, което може да се използва за елиминиране на фона на сигнала и грешките в сигнала между ямките, което е удобно за клиентите да използват в различни модели количествени PCR инструменти.

RT Лесно^TMII (Главен премикс за синтез на кДНК на първата верига заPCR в реално време)

-Ефективна способност за премахване на gDNA, която може да премахне gDNA в шаблона в рамките на 2 минути.

-Ефективна система за обратна транскрипция, отнема само 15 минути за завършване на синтеза на първата верига cDNA.

-Комплексни шаблони: шаблони с високо GC съдържание и сложна вторична структура също могат да бъдат обърнати с висока ефективност.

-Високочувствителна система за обратна транскрипция, шаблони на ниво pg също могат да получат висококачествена cDNA.

- Системата за обратна транскрипция има висока термична стабилност, оптималната реакционна температура е 42 ℃ и все още има добра производителност на обратна транскрипция при 50 ℃.