Изходен материал: РНК
Количествената PCR с обратна транскрипция (RT-qPCR) е експериментален метод, използван в PCR експерименти, използващи РНК като изходен материал.При този метод общата РНК или информационната РНК (mRNA) първо се транскрибира в комплементарна ДНК (cDNA) чрез обратна транскриптаза.Впоследствие беше проведена qPCR реакция, като се използва сДНК като шаблон.RT-qPCR се използва в различни приложения на молекулярната биология, включително анализ на генна експресия, валидиране на РНК интерференция, валидиране на микрочипове, откриване на патогени, генетично тестване и изследване на болести.
Едноетапни и двуетапни методи за RT-qPCR
RT-qPCR може да се извърши чрез едноетапен или двуетапен метод.Едноетапната RT-qPCR комбинира обратна транскрипция и PCR амплификация, позволявайки на обратната транскриптаза и ДНК полимераза да завършат реакцията в една и съща епруветка при същите буферни условия.Едноетапната RT-qPCR изисква само използването на праймери, специфични за последователността.При двуетапна RT-qPCR, обратната транскрипция и PCR амплификацията се извършват в две епруветки, като се използват различни оптимизирани буфери, реакционни условия и стратегии за дизайн на праймера.
| Предимство | Недостатък | |
| Една стъпка | Този метод има по-малка експериментална грешка, тъй като и двете реакции се извършват в една епруветка
По-малкото стъпки на пипетиране намаляват риска от замърсяване
Подходящ за високопроизводително усилване/скрининг, бърз и възпроизводим | Двустепенните реакции не могат да бъдат оптимизирани отделно
Тъй като условията на реакцията са компрометирани чрез комбиниране на двуетапната реакция, чувствителността не е толкова добра, колкото тази на двуетапния метод
Броят на целите, открити от една проба, е малък |
| Две стъпки | Възможност за създаване на стабилни cDNA библиотеки, които могат да се съхраняват за дълги периоди от време и да се използват в множество реакции
Целевите гени и референтните гени могат да бъдат амплифицирани от една и съща cDNA библиотека без необходимост от множество cDNA библиотеки
Реакционни буфери и реакционни условия, които позволяват оптимизиране на отделните реакционни цикли
Гъвкав избор на условия за задействане | Използването на множество епруветки и повече стъпки на пипетиране увеличава риска от замърсяване на ДНК, и отнема много време.
Изисква повече оптимизация от метода с една стъпка |
Свързани продукти:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Една стъпка)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Една стъпка)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix за CDNA синтез на първа верига
PCR в реално време Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
PCR в реално време Easyᵀᴹ-Taqman
Избор на обща РНК и иРНК
При проектирането на RT-qPCR експеримент е важно да се реши дали да се използва обща РНК или пречистена иРНК като шаблон за обратна транскрипция.Въпреки че иРНК може да осигури малко по-висока чувствителност, общата РНК все още се използва често.Причината за това е, че общата РНК има по-важно предимство като изходен материал от иРНК.Първо, процесът изисква по-малко стъпки на пречистване, което гарантира по-добро количествено възстановяване на шаблона и по-добро нормализиране на резултатите спрямо началния брой клетки.Второ, той избягва етапа на обогатяване на иРНК, което може да избегне възможността за изкривени резултати поради различно възстановяване на различни иРНК.Като цяло, тъй като в повечето приложения относителното количествено определяне на целевия ген е по-важно от абсолютната чувствителност на откриването, общата РНК е по-подходяща в повечето случаи.
Праймер за обратна транскрипция
В двуетапния метод могат да се използват три различни метода за праймиране на cDNA реакцията: олиго(dT) праймери, произволни праймери или специфични за последователността праймери.Обикновено олиго(dT) праймери и произволни праймери се използват в комбинация.Тези праймери се свързват с матричната иРНК верига и осигуряват обратна транскриптаза с начална точка за синтез.
| Избор на грунд | Устройство и функция | Предимство | Недостатък |
| Олиго(dT) праймер (или закотвен олиго(dT) праймер) | Разширено отгряване до тиминови остатъци в поли(А) опашката на иРНК;закрепващият олиго(dT) праймер съдържа G, C или A в 3' края (място на закрепване) | Синтез на сДНК с пълна дължина от иРНК с поли(А) опашка
Приложимо, когато е наличен по-малко изходен материал
Мястото на закрепване гарантира, че олиго(dT) праймерът се свързва с 5' поли(А) опашката на иРНК | Подходящ само за амплифициране на гени с поли(А) опашки
Получаване на сДНК, съкратена от мястото за праймиране*2 в поли(А)
Предубеден за свързване към 3′ края*
*Тази възможност е сведена до минимум, ако се използват закотвени олиго(dT) праймери |
| случаен грунд
| Дължина от 6 до 9 бази, която може да се свърже към множество места по време на РНК транскрипция | Свързване към всички РНК (tRNA, rRNA и mRNA)
Подходящ за транскрипти със значителна вторична структура или когато е наличен по-малко изходен материал
Висок добив на cDNA | cDNA се транскрибира обратно от цялата РНК, което обикновено не е желателно и може да разреди сигнала на целевата иРНК
получите скъсена cDNA |
| специфични за последователността праймери | Персонализирани праймери, насочени към специфични иРНК последователности | специфична cDNA библиотека
Подобрете чувствителността
Използване на обратни qPCR праймери | Ограничено само до синтеза на един целеви ген |
Обратна транскриптаза
Обратната транскриптаза е ензим, който използва РНК, за да синтезира ДНК.Някои обратни транскриптази имат РНКазна активност и могат да разграждат РНК вериги в РНК-ДНК хибридни вериги след транскрипция.Ако няма RNase ензимна активност, RNaseH може да се добави за по-висока ефективност на qPCR.Често използваните ензими включват обратна транскриптаза на миши левкемичен вирус на Moloney и обратна транскриптаза на птичи миелобластомен вирус.За RT-qPCR е идеално да се избере обратна транскриптаза с по-висока термостабилност, така че синтезът на кДНК да може да се извършва при по-високи температури, осигурявайки успешна транскрипция на РНК с по-висока вторична структура, като същевременно се поддържа пълната им активност по време на реакцията, което води до по-високи добиви на кДНК.
Свързани продукти:
Foreasy M-MLV обратна транскриптаза
РНКаза Н активност на обратната транскриптаза
RNaseH е в състояние да разгради РНК вериги от РНК-ДНК дуплекси, позволявайки ефективен синтез на двойноверижна ДНК.Въпреки това, когато се използва дълга иРНК като матрица, РНК може да се разгради преждевременно, което води до пресечена кДНК.Следователно, често е полезно да се минимизира активността на RNaseH по време на cDNA клониране, ако се желае синтез на дълги транскрипти.Обратно, обратните транскриптази с активност на RNase H често са полезни за qPCR приложения, тъй като те усилват топенето на РНК-ДНК дуплекси по време на първия цикъл на PCR.
Грунд дизайн
PCR праймерите, използвани за етапа на qPCR в RT-qPCR, в идеалния случай трябва да бъдат проектирани да обхващат връзка екзон-екзон, където амплификационният праймер потенциално може да обхване действителна граница екзон-интрон.Тъй като интрон-съдържащите геномни ДНК последователности не са амплифицирани, този дизайн намалява риска от фалшиви положителни резултати, амплифицирани от замърсяване на геномна ДНК.
Ако праймерите не могат да бъдат проектирани да разделят екзони или граници екзон-екзон, може да е необходимо да се третират РНК проби с ДНКаза I без РНКаза или dsDNаза, за да се премахне замърсяването на геномна ДНК.
RT-qPCR контрол
Отрицателна контрола за обратна транскрипция (-RT контрола) трябва да бъде включена във всички RT-qPCR експерименти за откриване на ДНК замърсяване (като геномна ДНК или PCR продукти от предишни реакции).Тази контрола съдържа всички компоненти на реакцията с изключение на обратната транскриптаза.Тъй като обратната транскрипция не възниква при тази контрола, ако се наблюдава PCR амплификация, най-вероятно е заразяване от ДНК.
Време на публикуване: 02 август 2022 г
