Няколко революционни изобретения в историята на технологията за откриване според мен са технологията за имуномаркиране, базирана на принципа на специфично свързване на антиген-антитяло, PCR технология и технология за секвениране.Днес ще говорим за PCR технологията.Според еволюцията на PCR технологията хората обичайно разделят PCR технологията на три поколения: обикновена PCR технология, флуоресцентна количествена PCR технология в реално време и цифрова PCR технология.
Cобикновена PCR техника
КАРИ МЪЛИС (1944.12.28-2019.8.7)
Кари Мълис изобретил полимеразната верижна реакция (полимеразна верижна реакция, PCR) през 1983 г. Говори се, че когато шофирал приятелката си, внезапно получил проблясък на вдъхновение и си помислил за принципа на PCR (за ползите от шофирането).Кари Мълис беше удостоен с Нобелова награда за химия през 1993 г. New York Times коментира: „Изключително оригинален и значим, почти разделящ биологията на епохи преди и след PCR.
Принципът на PCR: При катализата на ДНК полимеразата ДНК на майчината верига се използва като матрица и специфичният праймер се използва като начална точка на удължаване, а ДНК на дъщерната верига, комплементарна на матричната ДНК на веригата на майката, се копира in vitro чрез денатурация, отгряване, удължаване и други стъпки.Това е технология за усилване на ДНК синтез in vitro, която може бързо и специфично да амплифицира всяка целева ДНК in vitro.
Предимства на обикновената PCR
1.Класически метод, пълни международни и вътрешни стандарти
2.По-ниска цена на инструменталните реагенти
3.PCR продуктите могат да бъдат възстановени за други експерименти по молекулярна биология
Препоръчителна машина за PCR Foregene: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Свързани продукти: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Недостатъци на обикновената PCR
1.лесен за замърсяване
2.тромава операция
3.само качествен анализ
4.Умерена чувствителност
5.Има неспецифично усилване и когато неспецифичната лента е със същия размер като целевата лента, тя не може да бъде разграничена
CPCR на базата на апиларна електрофореза
В отговор на недостатъците на обикновената PCR, някои производители са въвели инструменти, базирани на принципа на капилярната електрофореза.Етапът на електрофореза след PCR амплификация е завършен в капиляра.Чувствителността е по-висока и разликата от няколко бази може да се различи и усилването може да се изчисли от MAERKER.съдържание на продукта.Недостатъкът е, че PCR продуктът все още трябва да бъде отворен и поставен в инструмента и все още съществува голям риск от замърсяване.
CапилярнаEелектрофореза
2. Флуоресцентна количествена PCR в реално време (Quantitative Real-time PCR, qPCR) технологияФлуоресцентната количествена PCR, наричана още PCR в реално време, е нова технология за количествено определяне на нуклеинова киселина, разработена от PE (Perkin Elmer) през 1995 г. Историята на развитието на флуоресцентната количествена PCR е история на вълнуващи борби на гиганти като ABI, Roche и Bio-Rad.Ако се интересувате, можете да го разгледате.Тази техника в момента е най-зрялата и широко използвана полуколичествена PCR техника.
Препоръчителна qPCR машина: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Метод на флуоресцентно багрило (SYBR Green I):SYBR Green I е най-често използваното ДНК-свързващо багрило за количествена PCR, което се свързва неспецифично с двойноверижна ДНК.В свободно състояние SYBR Green излъчва слаба флуоресценция, но след като се свърже с двойноверижна ДНК, неговата флуоресценция се увеличава 1000 пъти.Следователно, общият флуоресцентен сигнал, излъчван от реакцията, е пропорционален на количеството налична двойноверижна ДНК и ще се увеличи с увеличаването на амплифицирания продукт.Тъй като багрилото се свързва неспецифично с двойноверижна ДНК, могат да се генерират фалшиви положителни резултати.
Свързани продукти: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Метод на флуоресцентна сонда (технология Taqman): По време наPCR амплификация, специфична флуоресцентна сонда се добавя едновременно с двойка праймери.Сондата е линеен олигонуклеотид, с флуоресцентна репортерна група и флуоресцентна гасителна група, съответно белязани в двата края.Когато сондата е непокътната, флуоресцентният сигнал, излъчван от репортерната група, се абсорбира от гасителната група и откриването Няма флуоресцентен сигнал;по време на PCR амплификация (в етапа на удължаване), 5'-3' Dicer активността на Taq ензима ще усвои и разгради сондата, така че репортерната флуоресцентна група и гасителната флуоресцентна група да бъдат разделени, така че системата за наблюдение на флуоресценцията. Флуоресцентният сигнал може да бъде получен, т.е. всеки път, когато се усилва ДНК верига, се образува флуоресцентна молекула, която осъществява пълната синхронизация на натрупването на флуоресцентни сигнали и образуването на PCR продукти.Методът на сондата Taqman е най-често използваният метод за откриване при клинично откриване.
Свързани продукти: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Предимства на qPCR
1.Методът е зрял и поддържащото оборудване и реагентите са завършени
2.Средна цена на реагентите
3.лесен за използване
4.Висока чувствителност и специфичност на откриване
Недостатъци на qPCR
Мутацията на целевия ген води до пропуснато откриване.
Резултатът от откриване на шаблон с ниска концентрация не може да бъде определен.
Има голяма грешка при използване на стандартната крива за количествено откриване.
3. Цифрова PCR (цифрова PCR, dPCR) технология
Дигиталната PCR е техника за абсолютно количествено определяне на молекулите на нуклеинова киселина.В сравнение с qPCR, цифровата PCR може директно да разчете броя на ДНК/РНК молекулите, което е абсолютното количествено определяне на молекулите на нуклеиновата киселина в началната проба.През 1999 г. Bert Vogelstein и Kenneth W. Kin-zler официално предложиха концепцията за dPCR.
През 2006 г. Fluidigm беше първият, който произведе търговски dPCR инструмент, базиран на чип.През 2009 г. Life Technologies пусна на пазара системите OpenArray и QuantStudio 12K Flex dPCR.През 2013 г. Life Technologies стартира системата QuantStudio 3DdPCR, която използва наномащабна микрофлуидна чипова технология с висока плътност за равномерно разпределяне на проби в 20 000 отделни клетки.в реакционния кладенец.
През 2011 г. Bio-Rad пусна базирания на капчици QX100 dPCR инструмент, който използва технология вода в масло за равномерно разпределение на пробата до 20 000 капчици вода в масло и използва капков анализатор за анализ на капчиците.През 2012 г. RainDance пусна инструмента RainDrop dPCR, задвижван от газ под високо налягане, за разделяне на всяка стандартна реакционна система в реакционна емулсия, съдържаща 1 милион до 10 милиона микрокапки на ниво пиколитър.
Досега дигиталната PCR формира две основни фракции, тип чип и тип капка.Без значение какъв вид дигитален PCR, неговите основни принципи са ограничаване на разреждането, крайна точка PCR и разпределение на Поасон.Стандартната PCR реакционна система, съдържаща шаблони на нуклеинови киселини, е равномерно разделена на десетки хиляди PCR реакции, които се разпределят в чипове или микрокапки, така че всяка реакция да съдържа колкото е възможно повече шаблонна молекула и се извършва PCR реакция с единична молекула.Чрез отчитане на флуоресценцията Наличието или отсъствието на сигнала се отчита и абсолютното количествено определяне се извършва след калибриране на статистическото разпределение на Поасон.
По-долу са характеристиките на няколко цифрови PCR платформи, които съм използвал:
1. Bio-Rad QX200 капков цифров PCR Bio-RadQX200 е много класическа цифрова PCR платформа, основният процес на откриване: 20 000 проби се генерират от генератора на капчици. Микрокапките вода в масло се усилват на обикновена PCR машина и накрая флуоресцентният сигнал на всяка микрокапчица се чете от четец на микрокапчици.Операцията е по-сложна, а рискът от замърсяване е среден.
Xinyi TD1 микро-капкова цифрова PCRXinyi TD1 е домашна цифрова PCR платформа, основният процес на откриване: генериране на 30 000-50 000 капчици вода в масло чрез генератор на капчици, усилване на общ PCR инструмент и накрая преминаване. Четецът на капчици чете флуоресцентния сигнал на всяка капчица.Както генерирането на капки, така и четенето в тази платформа се извършват в специален чип с нисък риск от замърсяване.
Цифров PCR с чип с микрокапчици STILLA NaicaSTILLA Naica е сравнително нова цифрова PCR платформа.Основният процес на откриване е: добавете реакционния разтвор към чипа, поставете чипа в системата за генериране и усилване на микрокапчици и генерирайте 30 000 микрокапчици.Разнесете върху чипа и PCR амплификацията е завършена върху чипа.След това усиленият чип се прехвърля в системата за анализ на четенето на микрокапки и флуоресцентният сигнал се чете чрез правене на снимки.Тъй като целият процес се извършва в затворен чип, рискът от замърсяване е нисък.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D чип дигитален PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D е друга класическа цифрова PCR платформа, базирана на чип.Неговият основен процес на откриване е: добавете реакционния разтвор в разпределителя и разпределете реакционния разтвор равномерно върху чипа с 20 000 микроямки през разпръсквача., поставете чипа върху PCR машината, за да се усили, и накрая поставете чипа в четеца и направете снимка, за да прочетете флуоресцентния сигнал.Операцията е сравнително сложна и целият процес се извършва в затворен чип и рискът от замърсяване е нисък.
5. JN MEDSYS Clarity чип дигитален PCR
JN MEDSYS Clarity е сравнително нова цифрова PCR платформа от тип чип.Неговият основен процес на откриване е: добавете реакционния разтвор в апликатора и разпределете реакционния разтвор равномерно върху 10 000 PCR епруветки, фиксирани в PCR епруветката през апликатора.На микропорестия чип реакционният разтвор навлиза в чипа чрез капилярно действие и PCR тръбата с чипа се поставя върху PCR машината за амплификация и накрая чипът се поставя в четеца, за да се прочете флуоресцентният сигнал чрез правене на снимка.Операцията е по-сложна.Рискът от замърсяване е нисък.
Параметрите на всяка цифрова PCR платформа са обобщени, както следва:
Индикаторите за оценка на цифровата PCR платформа са: брой разделени единици, брой флуоресцентни канали, сложност на работа и риск от замърсяване.Но най-важното е точността на откриване.Един от начините за оценка на цифрови PCR платформи е да се използват множество цифрови PCR платформи, за да се проверяват взаимно, а друг начин е да се използват стандартни вещества с точни стойности.
Предимства на dPCR
1.Постигане на абсолютна количествена оценка
2.По-висока чувствителност и специфичност
3.Може да открие проби с малко копие
Недостатъци на dPCR1. Скъпо оборудване и реагенти 2. Сложна работа и дълго време за откриване 3. Тесен обхват на откриване
Понастоящем трите поколения PCR технология имат своите предимства и недостатъци и всяко има свои собствени области на приложение и не е връзка едно поколение да замества другото.Непрекъснатият напредък на технологията инжектира нова жизненост в PCR технологията, позволявайки й да отключва една посока след друга, което прави откриването на нуклеинова киселина по-удобно и точно.
Източник: Д-р Юан ви води на тест
Препоръчителни продукти:
Време на публикуване: 18 ноември 2022 г
