1. Открийте абсорбцията на РНК разтвор
Абсорбцията при 280, 320, 230 и 260 nm представлява съответно стойностите на нуклеинова киселина, фон (мътност на разтвора), концентрация на сол и органична материя като протеин.Обикновено гледайте само OD260/OD280 (съотношение, R).Когато 1,8~2,0, смятаме, че замърсяването на протеин или друга органична материя в РНК може да бъде толерирано, но трябва да се отбележи, че когато Tris се използва като буфер за откриване на абсорбцията, стойността на R може да бъде по-голяма от 2 (обикновено трябва да бъде <2,2).Когато R<1,8, замърсяването на протеин или друга органична материя в разтвора е по-очевидно и съдбата на РНК може да се определи според нуждите.Когато R>2.2, това означава, че РНК е хидролизирана в единична нуклеинова киселина.
2. Електрофоретичен модел на РНК
Обикновено денатуриращият гел се използва за РНК електрофореза, но ако е само за откриване на качеството на РНК, денатуриращият гел не е необходим и може да се използва обикновен агарозен гел.Целта на електрофорезата е да се открие целостта на 28S и 18S лентите и тяхното съотношение или целостта на иРНК петна.Като цяло, ако лентите 28S и 18S са ярки, ясни и остри (отнасяйки се до ръбовете на лентите са ясни) и яркостта на 28S е повече от два пъти по-голяма от тази на лентата 18S, считаме, че качеството на РНК е добро.
Горните са двата метода, които обикновено използваме, но нито един от тези два метода не може ясно да ни каже дали има остатъчна РНКаза в РНК разтвора.Ако има много малко количество РНКаза в разтвора, за нас е трудно да го открием с горния метод, но повечето от последващите ензимни реакции се провеждат при над 37 градуса и за дълго време.По този начин, ако има много малко количество РНКаза в разтвора на РНК, тогава ще има много подходяща среда и време, за да изиграят ролята си в следващите експерименти и, разбира се, експериментът ще бъде студен по това време.По-долу представяме метод, който може да потвърди дали има остатъчна РНКаза в РНК разтвора.
3. Тест за запазване на топлината
В зависимост от концентрацията на пробата, изтеглете две 1000 ng РНК от разтвора на РНК и го добавете към центрофужна епруветка от 0,5 ml и я допълнете с рН 7,0 Tris буфер до общ обем от 10 ul и след това запечатайте капачката на епруветката.Поставете един от тях във водна баня с постоянна температура при 70°C и го оставете на топло за 1 час.Другата част се съхранява в хладилник при -20°C за 1 час.Когато времето изтече, извадете двете проби за електрофореза.След като електрофорезата приключи, сравнете електрофоретичните ленти на двете.Ако лентите на двете са последователни или нямат значителна разлика (разбира се, техните ленти също отговарят на условията в метод 2), това означава, че няма остатъчно замърсяване с РНКаза в разтвора на РНК и качеството на РНК е много добро.Напротив, ако пробата, инкубирана при 70°C, показва очевидно разграждане, това показва, че има замърсяване с РНКаза в разтвора на РНК.
2 Експериментални методи и техники за екстракция на РНК
Проблемите, които често срещаме при извличане на РНК са: (1) Добивът на РНК е нисък;(2) РНК има сериозно замърсяване със сол;(3) РНК има сериозно замърсяване с органични разтворители;(4) влошаване на пробата и други проблеми
1. Често използвани реагенти за екстракция на тотална РНК
Методът с гуанидин изотиоцианат и методът с тризол са най-често използваните методи за извличане на обща РНК от животински тъкани и животински клетки.Той е особено подходящ за малки проби и тъкани, които са особено трудни за извличане, като извличане на обща РНК от заешка кожа и животинска съединителна тъкан;в допълнение, Trizol, като реагент за лизис с общо предназначение, може да се използва и за екстракция на растителни тъкани, бактерии, гъбички и други тъкани.За растителни тъкани, съдържащи полизахариди и полифеноли, като камелия олеифера, чаени листа, рапица и др., методът CTAB може също да се използва за извличане на обща РНК.
Като конвенционален метод, методът с двойна колона също е много популярен поради работата си при нормална температура, няма нужда от добавяне на РНКаза и безопасност - без хлороформ, феноли и други органични реагенти за екстракция.(препоръчани продукти )
2. Екстракция на тотална РНК от животински тъкани
(1) Опитайте се да изберете прясна тъкан, ако не е прясна (за предпочитане в рамките на три месеца - 80 ℃ хладилник или замразена в течен азот. Когато режете тъкан, не режете директно при стайна температура, не забравяйте да я поставите върху кутията за лед, опитайте се да избегнете повторно замразяване и размразяване.
(2) Използвайте чисти ножици и пинсети, за да отрежете малко парче тъкан, опитайте се да отрежете централната част на тъканта, когато режете пробата, или първо отрежете голямото парче тъкан от средата и след това отрежете пробата в позицията на пресния разрез.Отстранената тъкан трябва да бъде напълно нарязана, поставете нарязаната тъкан в EP епруветка без РНКаза, добавете лизата, нарязаната тъкан трябва да бъде напълно изложена на лизата и се подготви за хомогенизиране.
(3) За нормални тъкани изберете тъкани с размер на зърно мунг (30-60 mg) за хомогенизиране.Ако тъканите съдържат голямо количество протеини, мазнини или плътни фиброзни тъкани като черен дроб, подходящо увеличете или намалете количеството нарязани тъкани (по избор) Изберете 10~20 mg).
(4) Ако се екстрахират рибни мускули, месо от скариди, медузи и други тъкани с високо съдържание на вода, обемът на пробата трябва да се увеличи по подходящ начин (препоръчва се 100-200 mg).
(5) Ако условията позволяват, животинската тъкан може да бъде директно екстрахирана след хомогенизиране с високопасажен тъканен хомогенизатор, ако няма такова оборудване.
(6) РНК, получена след окончателното извличане, трябва незабавно да се постави в кутията за лед, за да се намали разграждането на РНК.
3. Извличане на РНК от животински клетки
(1) Суспензионни клетки: центрофугирайте директно и изхвърлете средата, измийте със стерилен PBS 1-2 пъти, след това суспендирайте с подходящо количество PBS и след това добавете лизат за лизис.Не добавяйте лизата директно към утаените клетки след пълното изхвърляне на течността.Това ще накара хистоновия пакет, освободен след лизираните клетки на външния слой, да се прилепи към външната страна на утаените клетки, като по този начин ще ограничи контакта на клетките вътре в пелетата с лизата., което води до непълен клетъчен лизис и намален добив на РНК.
(2) Клетки, които са полу-прилепнали или неплътно прилепнали: След изхвърляне на средата, измийте с PBS 1-2 пъти, след това директно абсорбирайте подходящо количество PBS и продухайте съда с култура с пипета или пистолет, за да издухате клетките и ги прехвърлете в клетки без РНК.Добавете лизата към ЕР епруветката на ензима за екстракция.
(3) Прилепнали клетки: първо трябва да се усвоят с трипсин, след това да се съберат в свободни от РНКаза EP епруветки, да се центрофугират, за да се отстрани супернатантата, да се промият 1-2 пъти с PBS, за да се отстрани излишният трипсин, и да се ресуспендират с подходящо количество PBS, след което да се премине към етапа на екстракция.
4. Извличане на растителна РНК
Растителните тъкани са богати на фенолни съединения или богати на полизахариди, или съдържат някои неидентифицирани вторични метаболити, или имат висока активност на РНКаза.Тези вещества са плътно свързани с РНК след клетъчен лизис, за да образуват неразтворими комплекси или колоидни преципитати, които са трудни за отстраняване.Следователно, когато извличаме растителна тъкан, трябва да изберем комплект за растения.Лизатът в комплекта може ефективно да реши проблемите с лесното окисляване на полифенолите и разделянето на полизахаридни съединения и нуклеинови киселини.
(За екстракция на растителна РНК на полизахарид полифенол, препоръчителни продукти:
(1) Кората, пулпата, семената, листата и т.н. на растението трябва да бъдат напълно смлени в хаванче.По време на процеса на смилане течният азот трябва да се допълва навреме, за да се избегне стопяването на пробата.Смляната проба трябва бързо да се добави към лизата и да се разклати, за да се избегне разграждането на РНК.
(2) За проби, богати на фибри, като оризови и пшенични листа, количеството на екстракцията трябва да бъде подходящо намалено, в противен случай смилането и лизисът на тъканите няма да бъдат завършени, което води до нисък добив на извлечена РНК.
(3) За растителни тъкани с високо съдържание на вода, като плодове от нар, плодове от диня, плодове от праскови и др., размерът на пробата трябва да бъде подходящо увеличен (100-200 mg не е задължително).
(4) За растителни тъкани, като листа на растения, коренища, твърди плодове и други материали, обикновено се препоръчва да се използва течен азот за старателно замазване на съставките в хаван и след това да се премине към етапа на екстракция.Конвенционалните тъканни хомогенизатори може да не са ефективни при хомогенизиране на растителни тъкани и обикновено не се препоръчват.
5. Предпазни мерки при екстракция на РНК
(1) Тъканните проби трябва да са възможно най-свежи, за да се избегне повторно замразяване и размразяване.
(2) Тъканта трябва да бъде напълно смляна по време на екстракцията и количеството тъкан не трябва да бъде твърде малко, камо ли твърде много.
(3) Трябва да се даде достатъчно време за инкубация след добавяне на лизата, за да се лизира напълно пробата.
(4) Когато се използва методът Trizol за екстракция, принципът на абсорбиране на супернатанта след стратификация е „предпочитам да вдишвам по-малко, отколкото да вдишвам повече“ и не трябва да извлича до средния слой, в противен случай това ще причини сериозно замърсяване на геномна ДНК.
(5) При измиване промивната течност трябва напълно да се инфилтрира около стената на тръбата, за да се осигури цялостно измиване.
(6) За метода на екстракция на колоната, в допълнение към отделянето на колоната след измиване, адсорбционната колона също трябва да се постави в ултрачиста пейка и да се продуха за 5-10 минути, за да се изпари напълно органичният разтворител до сухо.
(7) При последното елуиране на колонния метод, след добавяне на DEPC вода, трябва да се инкубира за 3-5 минути или DEPC водата трябва да се загрее до 60°C предварително, за да се увеличи добивът на елуиране.При традиционния метод за разцепване на Trizol и утаяване с изопропанол, крайната РНК се разтваря в DEPC вода, така че трябва да се даде подходящо време за разтваряне и дъното на центрофужната епруветка трябва непрекъснато да се продухва с върха на пипетата.
3 Тhree Причини и решения за ниска концентрация на РНК/лошо качество
1. Добивът е твърде нисък
Екстрахираната проба е твърде ниска, общото количество е недостатъчно или извлечената проба е твърде много и лизисът не е завършен;тъканта или клетките с подходящо качество трябва да се използват за екстракция, предварителната обработка на пробата трябва да бъде извършена добре и лизисът трябва да е достатъчен.
2. Геномни остатъци
При екстрахиране по метода Trizol, когато супернатантата се засмуква в средния слой след наслояване, ще бъде причинено сериозно замърсяване на генома;трябва да се внимава особено при наслояване, за да се избегне засмукване в средния слой.Ако за екстракция се използва колонният метод, за екстракция може да бъде избран комплект, съдържащ DNase I.Нуклеиновата киселина, адсорбирана върху мембраната, се усвоява директно с ДНКаза I, което може значително да намали ДНК остатъците.
3. Разграждане на РНК
Това може да е разграждането на самата извлечена проба или разграждането, причинено по време на процеса на екстракция;доколкото е възможно, пресни проби трябва да се използват за екстракция на РНК, а събраните проби трябва да се съхраняват в течен азот или в хладилник -80°C навреме и трябва да се избягва повторно замразяване и размразяване.В процеса на екстракция на РНК трябва да се използват накрайници без РНКаза/ДНКаза, центрофужни епруветки и други материали.Процесът на извличане трябва да бъде възможно най-бърз.Екстрахираната РНК трябва да се постави върху кутия за лед и да се съхранява при -80 във времето.Ако екстрахираната РНК трябва да бъде открита чрез гел електрофореза, електрофорезата трябва да се извърши веднага след екстракцията и буферът за електрофореза трябва да се замени с новоприготвен такъв.
4. Остатъци от сол и органичен разтворител
Екстракционните реагенти съдържат фенол и гуанидинови соли, а промивният разтвор съдържа етанол.По време на процеса на екстракция лизатът не беше напълно абсорбиран и изхвърлен, а промивният разтвор не беше напълно изсушен.Остатъчните соли и органичните разтворители са вредни за последващата обратна транскрипция и PCR.Различни степени на инхибиране, така че тъканният лизат трябва да бъде напълно отстранен по време на процеса на екстракция и измиването трябва да е достатъчно, така че околните стени на тръбата да могат да бъдат измити.В допълнение, тръбата се изпразва и продухването е необходима стъпка, което допълнително ще намали остатъците от органични вещества.
За повече информация относно извличането на РНК, моля, следете нашия уебсайт:
www.foreivd.com за повече информация.
Време на публикуване: 1 декември 2022 г
